【题目】： Light-Response Bric-A-BracK/Tramtrack/Broad proteins mediate cryptochrome 2 degradation in response to low ambient temperature

【研究方向】：

【研究团队】：中国科学院分子植物科学卓越创新中心研究员刘宏涛研究组

【DOI】：https://doi.org/10.1093/plcell/koab219

【abstract】：

隐花色素(Crys)是一种类似光解酶的蓝光受体，其不仅参与蓝光响应，还参与温度响应；但温度是否以及如何调节CRY蛋白的稳定性仍不清楚。作者证明了Cry2蛋白的丰度受环境温度的调节，并且Cry2 蛋白在低温下通过26S蛋白酶体降解。与此一致，Cry2在较低的环境温度下显示出高水平的泛素化。有趣的是，低环境温度下的cry2降解仅在蓝光下发生，不在红光或黑暗条件下发生，表明CRY2在低环境温度下的降解依赖于蓝光。此外作者发现在低温外界环境下，E3泛素连接酶底物LRB与Cry2互作，通过调节其泛素化和蛋白质的稳定性来响应环境温度。总结来说，Cry2的积累不仅受环境温度的影响还受蓝光的调节，LRB在低温下对Cry2的降解起着重要作用，在高温下通过调节cry2蛋白的稳定性使cry2作为温度响应负调节器发挥功能。

【文章基于背景】：

•    光对植物的生长发育起着决定性的作用。光受体蛋白能够感受环境中光质、光强、光周期、光照方向的变化，通过与下游信号蛋白的互作调控基因表达，使生物体发生与周围环境相适应的生理变化。隐花色素（Cryptochrome，CRY）是目前已知分布最广泛的光受体。CRY的丰度和活性受磷酸化，泛素化和蛋白水解调节,

•    Cry1和Cry2主要介导蓝光抑制下胚轴的伸长和开花的光周期调控，蓝光激活的CRY经历寡聚化成为活性的二聚体或四聚体，其与信号蛋白如CIB1或PIF4相互作用以转导信号.

•    COP1是一种环指E3泛素连接酶，作用于光敏色素(Phys)、Crys和紫外线抗性基因8(UVR8)下游。cop1蛋白抑制子SPA1与cop1互作正向调节cop1的活性，而Crys和phys则通过依赖光与spa1和cop1形成复合物来抑制cop1的E3泛素连接酶的活性，COP1参与调解响应蓝光cry2 的降解，目前还不清楚是否有其他E3泛素连接酶参与这一过程。

•     除了光，温度也是影响植物生长和发育的关键环境信号，温度通过染色质重塑和转录激活来调节基因的表达。蓝光和Crys抑制高温促进的下胚轴伸长，并调节生物钟的温度补偿，调节依赖温度的节间伸长和维持植物生物量。Cry的积累是否以及如何受到环境温度的调节尚不清楚。

【结果】：

1.温度升高正向调节了Cry2的蛋白积累水平。

 由于之前文章报道环境温度不影响Cry基因的转录，所以作者想看一下蛋白水平是否受到影响，将22℃持续白光生长6 d的Col-0幼苗在16℃或28℃处理24 h后转移到28℃或16℃，按一定时间间隔取样，免疫印迹实验显示CRY2蛋白在28℃条件下蛋白增多而在16℃条件下蛋白减少。Q：C2阴性对照设置的意义是？

2.Cry2通过26S蛋白酶体在低温下降解，并且这些降解是需要依赖于蓝光条件

作者针对这一现象，鉴于光和泛素/26S蛋白酶体依赖的蛋白水解是与许多光信号蛋白相关的共同机制

，猜想CRY2蛋白的增多和减少和降解有关。通过对GFP-cry2 protein采用CHX(蛋白质生物合成抑制剂)和MG132(26S蛋白酶体抑制剂)处理结果得出在较低的环境温度下，26S蛋白酶体可以降解Cry2蛋白，而较高的环境温度会抑制Cry2蛋白的降解。此外图D显示在低环境温度下cry2降解是蓝光依赖性的，只有蓝光激活的cry2响应低温而降解。红光和黑暗都不行。

3.LRBs参与调节CRY2在低温下的降解

之前有文章报道LRB1、LRB2和LRB3可以招募红光感受器光敏色素B(PhyB)和光敏色素相互作用因子3(PIF3)通过26S蛋白酶体途径促进体内两种底物的泛素化和随后的共降解响应光信号。为了检测LRBs是否影响了Cry2在低温下的稳定性。作者分别做了两个实验：实验一检测lrb突变体中是否还存在低温下降解的现象，图AB表明当植株从28℃转移到16℃时，lrb1、lrb2、lrb3突变体的Cry2含量没有显著下降，因此，LRBs参与调节Cry2在低温下的降解。实验二检测泛素化水平，图C将生长在22℃白光下的10日龄幼苗在黑暗下预培养24h，其中一半移至蓝光，其余则置于黑暗，2h后采集幼苗进行TUBE2-IP检测。结果表明，CRY2在蓝光条件下的泛素化水平显著升高。图D将生长在22℃白光下的10日龄幼苗在28下℃预培养24h，其中一半移至16℃，其余则置于28℃，结果表明，lrb1、lrb2、lrb3突变体的Cry2泛素化水平比野生型显著降低.

环境温度不影响LRBs的转录，因此作者检测了蛋白水平，发现LRB1和LRB2的积累受环境温度的调节（EFGHI），而Cry2的低温降解并不是由于低温下LRB蛋白的大量积累所致。Q按理来说，如果LRB参与CRY2在低温下的降解，为什么他们两的蛋白积累水平的变化是一致的呢?

4.Cry2与LRBs在物理上相互作用

体外pull-down、BiFC、co-IP实验表明Cry2与LRB1、LRB2和LRB3相互作用（ABC）.为了确定环境温度是否影响Cry2和LRBs之间的相互作用，IP分析方法研究了28℃和16℃下Cry2-LRB1和Cry2-LRB2复合物的形成。图D表明低温下Cry2-LRB1/LRB2复合物在植物细胞中积累更多。Q：cry和LRB在之前的研究中都是低温下变少，但低温是否影响其互作的实验中，用MG132预处理幼苗1h，以阻止低温促进的Cry2和LRB的降解。那低温下他们互作变多就不是真实的情况下发生的呀？

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5.LRBs调节下胚轴伸长对环境温度的响应

蓝光和Cry1通过抑制PIF4抑制高温促进的下胚轴伸长，cry1和cry2都与PIF相互作用，表明cry2也参与环境温度促进的下胚轴伸长（前人研究）。WT、cry2和35S：：GFP-CRY2幼苗在16℃或28℃处理5天后，在12h蓝光/12h暗条件下记录下胚轴伸长。与WT相比，Cry2突变体在28℃时的下胚轴伸长比16℃下的下胚轴伸长大，而GFP-CRY2OE的幼苗在较高温度下仅适度伸长，表明蓝光激活的Cry2也抑制了高温诱导的下胚轴伸长。lrb1 lrb2 lrb3突变体的下胚轴伸长对环境温度的变化不敏感，表明lb1、lrb2、lrb3突变体抑制高温诱导的下胚轴伸长。