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DNA损伤可能会引起突变甚至癌症的发生,因此,DNA损伤修复是维持基因组完整性和稳定性所必需的机制。核苷酸切除修复(NER)途径是DNA损伤修复的机制之一,它负责清除由紫外线照射或化学药品(如顺铂)引起的大量DNA加合物。
SIRT6是NAD+依赖性组蛋白/蛋白质去乙酰化酶家族的成员,具有去乙酰化酶和ADP-核糖基转移酶的活性。SIRT6可以通过不同方式促进DNA修复来维持基因组的完整性,比如通过促进DNA双链断裂修复稳定基因组,从而起到抑制肿瘤的作用。但是,SIRT6是否参与NER,以及其潜在的相关调控机制仍是未知的。
近日,同济大学生命科学与技术学院毛志勇教授团队在Nucleic Acids Research(IF=11.501)杂志上发表了去乙酰化酶SIRT6促进UV诱导的DNA损伤修复的研究,首次系统地阐述了SIRT6在NER通路中的功能。研究人员通过结合LC-MS/MS和免疫共沉淀等实验方法,揭示了SIRT6 可以利用自身去乙酰化酶活性把NER通路中识别损伤的DDB2蛋白去乙酰化,并促进该蛋白泛素化,进而使其从染色质上分离,促进NER通路的信号传导。本研究中蛋白的乙酰化修饰位点鉴定由景杰生物提供技术支持。
1. SIRT6促进UV诱导的DNA损伤修复
研究人员首先通过UV损伤质粒再活化的实验方法检测NER效率,结果表明,与SIRT6存在或缺失相关的NER效率变化是由DSB修复能力改变引起的。接着,研究人员检测了与SIRT6存在或缺失相关的UV照射下细胞的变化,结果显示SIRT6过表达显着抑制了UV诱导的细胞凋亡。此外,通过激光微辐照实验证实SIRT6可在DNA损伤位点发挥其NER功能。以上实验强有力地表明,SIRT6参与调控NER途径,通过促进NER和防止UV诱导的细胞凋亡来维持基因组完整性和稳定性。
图1 SIRT6通过抑制UV诱导的细胞凋亡来促进细胞存活
2. SIRT6依赖于其酶活性修复UV诱导的DNA损伤
为探究SIRT6对NER的调控是否取决于其酶活性,研究人员用烟酰胺对细胞进行预处理,烟酰胺是SIRT6催化反应的产物,能够通过与NAD+竞争和SIRTuin蛋白结合抑制SIRT6酶活性,然后分析NER效率。结果显示在烟酰胺存在时,过表达SIRT6对NER的促进作用被消除,这表明SIRT6对NER的调控取决于其酶活。此外,SIRT6突变实验表明,SIRT6具有的核糖基转移酶活性和去乙酰化酶活性是促进UV引起的DNA损伤修复的必需条件。
图2 SIRT6突变致失活会损害SIRT6促进NER的能力
3. SIRT6通过靶向GG-NER途径中的损伤识别蛋白DDB2参与NER通路
研究在进一步证明SIRT6参与全基因组修复(GG-NER)途径后,通过co-IP实验发现SIRT6可与DDB2相互作用。随后,研究人员探究了SIRT6促进NER的调控机制。研究表明,在UV照射下,SIRT6和DDB2之间的相互作用增强。通过质谱及进一步实验证实,SIRT6通过去乙酰化DDB2上的K35和K77两个赖氨位点,下调其乙酰化水平,从而促进DDB2泛素化并从染色质中解离,最终促进后续的NER信号级联并完成UV引起的损伤修复。
图3 SIRT6通过去乙酰化DDB2参与GG-NER的模型图
4. 黑色素瘤患者源性SIRT6突变导致NER效率降低
最后,为了确定黑色素瘤患者中自然突变的SIRT6是否会致使NER通路失活从而促进肿瘤发生,研究人员分析了黑素瘤患者源性SIRT6突变。结果显示,由于SIRT6突变导致的酶活性部分丧失(P27S,H50Y)、无义突变(R150*)或高转换率(G134W),会影响SIRT6对NER的调控作用,并使基因组失稳,从而促进黑素瘤的发生。
图4 黑素瘤中SIRT6突变破坏UV诱导的DNA损伤修复
研究人员发现SIRT6可促进UV诱导的DNA损伤修复,通过进一步系列实验阐明SIRT6通过GG-NER靶向DDB2促进DNA修复。同时,本研究也揭示了SIRT6是黑素瘤形成过程中一个重要的肿瘤抑制因子,激活 SIRT6 可能有助于稳定基因组,从而防止UV诱导的黑色素瘤形成。本研究成果进一步拓展了我们对肿瘤领域SIRT6调控DNA修复的理解,首次证明SIRT6是NER的正向调控因子。
参考文献:
1. Anke G, Huanyin T, Jin H, et al. The deacetylase SIRT6 promotes the repair of UV-induced DNA damage by targeting DDB2. Nuclc Acids Research.
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