OsSPX4通过与OsPHR2互作负调控水稻控磷酸盐信号和磷酸盐稳态

名称：SPX4 Negatively Regulates Phosphate Signaling and Homeostasis through Its Interaction with PHR2 in Rice (2016)

第一作者：Qundan Lv,

通讯作者：吴平教授

第一单位：浙江大学

DOI：www.plantcell.org/cgi/doi/10.1105/tpc.114.123208

PHR2是水稻磷信号途径的关键调节因子，在Pi缺乏时，可以通过增强PSIs基因的表达，提高Pi获取。但是PHR2不响应Pi饥饿，那么PHR2是如何被激活去调节适应不同Pi状态的呢？近期的研究表明，NRT1.1B-SPX4-PHR2是N-P调控网络的关键分子模块，该论文是SPX4和PHR2的互作关系证明。

前言

At-PHR通过和P1BS（PHR1结合序列）结合，激活PSIs基因表达，磷酸盐剂量性的调节磷饥饿响应，水稻中Os-PHR2具有相同的功能。At-PHR1和At-PHL1 (PHR1-like1)调控分子模块至少存在3个Pi信号和稳态途径：第一，PHR1正调控IPS1和miR399，从而调控PHO2的转录，PHO2进一步调控PHO1蛋白的稳定性，最终介导Pi木质部维管束的装载，其中miR399介导PHO2的剪切，而IPS1干扰miR399对PHO2的靶向作用。第二，At-PHR1 (PHR2)正调控miR827对SPX-MFS1和SPX-MFS2的剪切作用。第三，PHR2直接调控Pi转运基因，如PT2（地下向地上Pi转运）。

水稻中有6个SPX家族蛋白，除了OsSPX4均正调控Pi饥饿反应。水稻SPX1, SPX3和SPX5负调控 PHR2，但负调控机制和SPX功能的差异尚不清楚。

结果

1、  SPX4和PHR2互作

利用高低Pi条件下的水稻OE-PHR2-FLAG转基因株系进行Co-IP 实验，寻找有无磷下的差异蛋白，并用LC-MS鉴定，发现了4个蛋白，其中有一个为SPX4 (LOC_Os03g61200)。利用Y2H和Pull-Down实验进一步对SPX4-PHR2的互作进行验证，表明SPX4可以和PHR2的C端的MYB-CC结构域直接互作。

2、  SPX4负调控PHR2

OE-SPX4在正常情况下生长受到抑制，地上部分的Pi含量下降，PSIs显著下降，表明SPX4参与维持Pi稳态。OE-PHR2株系高磷状态下地上部分Pi过度积累（老叶出现坏死症状），PSIs表达上调，但被OE-SPX4导入后抑制。spx4突变体高磷状态下生长受到抑制，地上部分Pi积累增多IPS1, miR399，miR827，PT2及PSIs等PHR2下游基因下调，表明SPX4通过抑制PHR2的活性负调控Pi信号。EMSA和ChIP-qRT实验表明SPX4本身不能结合到P1BS（-LIKE）基序，但通过与PHR2互作抑制PHR2结合到P1BS基序上。

3、   SPX4蛋白的稳定性依赖于细胞内磷酸盐水平

GUS染色和原位杂交实验表明在高磷状态下，SPX4主要在根细胞，叶肉和叶维管束中表达，但表达水平在无Pi条件下下降。在磷饥饿条件下，SPX4蛋白的随着时间的正常而不断减少，在添加Pi后，又迅速恢复，表明Pi饥饿加速SPX4蛋白的降解。细胞外降解实验表明，Pi或者类似物在体外促进SPX4的稳定性。

4、   SPX4蛋白抑制PHR2的质核转移

SPX4定位在质膜和细胞核。SPX4和PHR2的BiFC实验表明，PHR2可以在细胞核中形成同源二聚体，当SPX4-GFP和PHR2-mCherry共表达时，PHR2信号主要在质膜上，核中信号减少。对WT，spx4，OE-SPX4不同背景下细胞质和细胞核中的PHR2蛋白水平检测，发现spx4背景下质膜和细胞核中的PHR2蛋白增高，但核中蛋白增加的更加显著；OE-SPX4背景的细胞核中PHR2蛋白显著减少，而细胞质中的PHR2含量无显著变化。

总结：

SPX4通过抑制PHR2的质核转移，抑制PHR2对下游PSIs的激活作用。在高Pi状态下，SPX4在细胞质和细胞核中与PHR2互作，在核中抑制PHR2 对PSIs基因启动子P1BS基序的结合能力；在Pi缺乏时，SPX4通过26S泛素化蛋白酶体途径降解，降低了对PHR2的抑制作用，PHR2进入核中启动下游PSIs基因的表达。