DNA斑点杂交实验（5mC，5hmC，8-oxo-G）

实验目的：对细胞基因组的碱基加合物的检测。

试剂耗材：

          （1）动物组织细胞基因组DNA提取试剂盒。

          （2）PBST（0.05%之Tween20的PBS）。

          （3）脱脂奶粉PBST（PBST+5%脱脂奶粉）。

          （4）NC膜。

          （5）铅笔。

          （6）尼龙膜。

          （7）一抗，二抗等。

          （8）紫外灯。

实验样品：用各类试剂处理过的细胞或动物组织为DNA来源。

实验步骤：

          （1）提取基因组DNA，测DNA浓度。

          （2）在尼龙膜上用铅笔画出行伍格。

          （3）将DNA稀释成不同浓度梯度（最高浓度20-200ng/μL，最低2ng/μL）。

              加入微量（2-5μL）的0.1M NaOH。

99度5分钟变性，立即置于冰上。

加入0.1倍体积的6.6M 醋酸铵。（黄色部分不必做）

加50mM NaCl，以防止指环结构（ring structure）出现。

每个样品，取2μL DNA（减小样品的体积，有助于防止指环结构出现，可以改为0.5μL）。加入格子的中心。液体通常渗透到3-4mm直径大小。直径大小可以不必3-4mm，1-2mm即可。可以反复加1μL液体。

          （4）晾干尼龙膜+紫外线照射30。紫外线可能对DNA产生影响，因此改为3.8%多聚甲醛处理30min。多聚甲醛处理时，尼龙膜可以置于湿盒中。

          （5）在反应池中，用5%脱脂奶粉PBST封闭1小时，室温（或4度过夜）。

          （6）PBST+0.1%脱脂奶粉稀释的一抗，处理1小时，室温（或4度过夜，最好过夜）。

          （7）PBST洗3次，5分钟每次。

          （8）二抗孵育1小时，室温。二抗是否可以用偶连荧光分子者，待尝试。

          （9）洗三次。

          （10）曝光。

问题分析：

          （1）红色部分比较重要，如果有紫外交联仪，可以进行调整。

          （2）仔细设计浓度梯度。

          （3）要设计好阴性对照和阳性对照。