Proteomics integrated with metabolomics: analysis of the internal causes of nutrient changes in alfalfa at different growth stages

多组学方法解析双酚A对斑马鱼授精后胚胎代谢的影响

Environmental Pollution，2017，IF=4.35

研究材料：斑马鱼胚胎

技术平台：LC-MS/MS

方案设计：

1）选择不同浓度BPA溶液（对照，4.4mMBPA，8.8 mMBPA, 17.5 mMBPA）对受精后2h斑马鱼胚胎进行暴露处理 ；

2）暴露处理斑马鱼胚胎120h后，取样进行代谢组检测和分析，代谢组样品为4组样本，每组样本6个生物学重复，每个生物学重复10个胚胎；

3）暴露处理斑马鱼胚胎120h后，选择对照组和17.5mMBPA处理组斑马鱼胚胎进行转录组测序，每组3个生物学重复，每个重复8个胚胎；

4）对差异代谢物及差异基因KEGG分析，相关性分析，解析暴露于BPA环境中，斑马鱼胚胎代谢机制的变化；

研究背景:

双酚A（BPA）是一种常用的工业化学品，广泛用于制造聚碳酸酯塑料和环氧树脂，BPA衍生塑料通常用于生产各种商品，包括容器，电子产品和医疗器械。随着时间的推移，BPA通过将其与塑料单体连接的酯键水解而从原始塑料中泄漏。因此，大量的BPA不断释放到环境中，特别是地表水和地下水，最终进入废水处理厂并最终沉积在沉积物中。然而，如果其在环境中浓度过高会激活雌激素活性，对人类健康，野生生物和环境具有重要威胁。除了假定的内分泌和生殖毒性，一些作者认为BPA暴露会破坏激素平衡，改变性腺功能，并影响鱼的肝脏卵黄蛋白原产生。然而，其中一些影响的作用方式尚不完全清楚。

结果：

1.BPA处理后的斑马鱼代谢检测

对24个胚胎提取物进行PCA分析(图1)，发现不同浓度BPA处理的胚胎可以明显分开。对检测到的代谢物进行差异筛选，正负离子模式下分别筛选到30，29种差异代谢物，其中共有代谢物为9种。对差异代谢物进行聚类分析，代谢物的分级聚类揭示了两个主要的簇，一个包括在BPA处理时浓度增加的代谢物，第二个包括通过处理耗尽的代谢物（图2）。聚类热图也反映出，当BPA浓度较低时，胚胎显示出与未处理一致，BPA处理的两个高浓度的变化一致。功能分析显示，受BPA影响的大多数代谢物与氨基酸或核苷酸/核苷代谢途径有关。通过BPA处理观察到的核苷酸相关代谢物的减少，特别是次黄嘌呤和尿酸，可以解释为信号传导途径的变化。嘌呤代谢主要在BPA处理时下调，可能与观察到的谷氨酸水平增加有关。除此之外，脂质，糖及其衍生物以及类固醇代谢相关的生化途径的变化，与先前的转录组学和代谢组学一致。并且甘油磷脂代谢的变化提示BPA对细胞膜的损伤。

图1 .24个胚胎样本代谢物检测PCA分析

图2. 对照组和处理组差异代谢物聚类热图分析

2.BPA处理后的斑马鱼转录组分析

通过对对照组和17.5 mM BPA组mRNA水平变化的统计评估，发现差异表达基因1381个(FDR<0.05)，其中上调基因765个，下调基因616个。根据BPA处理时的表达变化（图3a，b），差异表达的mRNA水平的分级聚类确定了两个主要簇。 簇A包含通过BPA暴露上调的表达基因，而簇B包括下调基因。这些前二十个基因与不同生物过程的反应有关，包括雌激素刺激和异生素，氧化还原过程，代谢过程， 鳍再生，组织发育和细胞增殖。与之前的报道具有一致性，脑芳香化酶(cyp19a1b)是众所周知的鱼胚胎雌激素暴露的标记物，其在BPA处理样本中表达的增加与脊椎动物中BPA的雌激素活性一致。双酚a对参与细胞增殖和组织发育的不同细胞功能的破坏，核苷酸和氨基酸合成途径的改变可能与这些效应部分相关。此外，gstp2 mRNA水平的上调可能与GST活性的增加有关，这是对氧化应激和细胞凋亡增加的反应。GST活性的变化被认为是BPA污染水生生态系统的一个标志。

图3 对照组和胁迫组差异基因聚类热图

3.代谢组学和转录通路联合分析来解析通路的变化
代谢组与转录组数据的整合提高了对缠在生物过程的理解，从而深入了解系统作用机制。本研究通过KEGG数据库定义的代谢通路，利用已有的生物学知识差异基因和代谢物的数据集进行评估。KEGG对差异代谢物和差异基因进行共同注释，注释到了70个通路，至少含有两个差异代谢物，38个通路至少含有4个代谢物。并且这38个通路至少含有2个差异基因，这个结果显示代谢组和转录组数据可以同时反映BPA胁迫对斑马鱼胚胎的影响（图5）。

4.代谢扰乱的生物相关性分析

筛选dre01100模块特有的45个差异代谢物和119个差异基因进行相关性网络图构建（图4）。其中与氨基酸代谢相关的基因和代谢物聚为第一大簇（图4，红色椭圆），与嘌呤代谢相关的生物标志物次之，但密度最大（图4，棕色椭圆）。因此，大部分代谢变化与蛋白和氨基酸的合成相关，是细胞的主要成分，与BPA胁迫导致的增值或者毒性相关。反映了BPA对鱼胚胎的信号/调节功能的破坏，这种活动与其作为内分泌干扰物的潜力有关。

通过基因和代谢物的上下调变化，可以推断观察到的不同生物标志物水平变化的生理意义（图4）。与嘌呤，视黄醇，叶酸和脂质代谢相关的大多数代谢物在BPA处理时浓度降低，而几种氨基酸浓度增加，这些变化与相同通路基因的变化也相关。氨基酰基trna合成的干扰与bpa处理的胚胎中氨基酸浓度的增加有关，可能与维持稳态所需能量的减少有关。氨基酸浓度的变化影响着下游几种依赖的代谢和生物合成途径。叶酸缺乏症对胚胎发育的潜在影响途径可能与BPA对机体的阻断作用有关，可能与抑郁症状有关。

图4. 差异代谢物和差异基因相关性网络图

类似地，BPA处理的胚胎样品中前列腺素（PGG2或6-酮-PGE1）浓度的降低可以通过观察到它们的产生酶ptgs2b的mRNA丰度的减少来解释。该效应与多达7种酶的表达增加相结合，所述酶催化来自共同前体，花生四烯酸或中间代谢物PGH2的替代途径（图5）

图5. (A)视黄醇和(B)花生四烯酸差异基因KEGG代谢通路图

结论：

代谢组和转录组分析，反映了将斑马鱼暴露于BPA中会导致明显的代谢变化。在通路水平上整合转录组学和代谢组学的结果，展示了BPA暴露后的受影响的代谢通路。这个结论显示，BPA和BPA-相关 化合物具有较强毒性作用，影响雌激素，雄激素，甲状腺癌，类视黄醇和前列腺素信号传导途径和胆固醇和脂质体内稳态。