睾丸生殖细胞的免疫荧光标记

实验目的：对雄性生殖细胞进行免疫荧光标记（铺片）。此方法还有待改善。

试剂耗材：

          （1）固定液：4%多聚甲醛，-20/-80冻存（长期）或四度保存（一个月）。

          （2）透膜液：PBS+0.1% 吐温+0.1% 或0.3%Triton X-100，过滤，4度或室温保存，具体浓度视所用材料与用途需要变化。

          （3）封闭液：PBS+0.1% 吐温+1%BSA，过滤，四度保存。

          （4）洗液：PBS+0.1% 吐温，过滤，4度或室温保存。

          （5）封片剂。

          （6）抗体：一抗和二抗都用封闭液稀释。

          （7）DNA染料：Hoechst33342，Hoechst33258，PI，DAPI。

          （8）羊毛脂：不可用指甲油。

          （9）湿盒：暗盒加水。

          （10）低渗液，100mM蔗糖溶液。

实验样品：雄性小鼠。

实验步骤：

          （1）分离雄鼠睾丸，将输精管加入到大约10mL低渗液中（柠檬酸盐低渗液，如果资金充足，可以加蛋白酶抑制剂，DTT自行选用），室温摇动30分钟。

          （2）用沸水煮载破片10分钟，晾干。（可省略）。

          （3）取出输精管。用100mM蔗糖悬浮细胞，滴加到普通载玻片或者培养皿上。用刀片切碎。

          （4）在载玻片上用胶水画大范围的圈，滴加固透液（比如1%多聚甲醛加0.25% Triton），使之铺展到圈内（如果胶水溶解，就需要用其它办法）。如果抗体足够，也可以在整张片子上操作。

          （5）将切碎的输精管，以20-30cm的高度滴加到固透液膜上。待其将干未干时，加入封闭液。

          （6）封闭液封闭30-60min。一抗（如SYCP3）二抗孵育清洗（可以室温1-2小时孵育抗体？）。Hoechst染核：大约1μg/mL为工作浓度，可进一步用洗液稀释。

          （7）滴加封片剂。盖上盖玻片，

问题分析：

          （1）主要问题是滴加抗体和清洗时，容易波及染色体，就像被水冲的水草一样。因此会损失一部分细胞。

          （2）精母细胞的减数分裂的各个阶段的认知？

          （3）**如何分辨抗体是否为特异性标记？