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最近按照文献总蛋白提取的办法进行组蛋白H3的WB,发现很难杂出H3大小的条带,可以杂出一条单一的非特异条带。可能是自己的技术不行,无法杂出条带来。最近发现下面这个方法终于可以杂出H3条带来。贴在这里提醒自己走的弯路。
稻瘟菌组蛋白的提取
1, 用灭过菌的刀片切取细菌块(尽可能的细)放入CM液体培养基,28度摇床,150rpm培养2天。(放入菌块不可贪多)
2, 收集菌体,利用液氮将菌丝研磨成粉。加入4 mL Lysis buffer(0.3 M sucrose, 0.04 M NaHSO3, 25 mMTris-HCl [pH 7.4], 0.01 M MgSO4, 0.5 mM EDTA, 0.5% NP-40, 1 mM PMSF, 1 μg/mlleupeptin, 1 μg/ml pepstatin),冰上摇动裂解5分钟。
3, 8000g,4度离心10分钟。去上清后再用2 mL Lysis buffer清洗一遍。
4, 用CW buffer(2 mL 0.15 M NaCl, 10 mM Tris-HCl[pH 8.0], 1 mM β-mercaptoethanol, 1 mM PMSF, 1 μg/ml leupeptin, 1 μg/mlpepstatin, mixed with 2 ml 0.4 M H2SO4)重悬菌体。4度孵育过夜。
5, 12000rpm4度离心10分钟,吸取上清质新的离心管中。在上清中加入1/4体积的100% TCA,冰上孵育1小时。
6, 12000rpm4度离心10分钟,丙酮清洗两边。
7, 最后沉降蛋白用1*SDS Loading buffer溶解蛋白。
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GMT+8, 2024-9-27 11:51
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