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最近做WB总是出各种问题,要么是背景很脏,要么条带很弱,要么是杂出不是目的条带,自己一边一边也再摸索,一下都是自己失败总结了一点心得。
Western Blot 注意事项
1, 切割稻瘟菌块时尽可能细,不贪多。
2, 液氮研磨尽可能细,全过程带手套和口罩,防止污染样品。
3, 提取蛋白过程全程保持4度低温,提完蛋白放入负80度一定提前分装,避免蛋白反复冻融。
4, 制作PAGE胶之前配置好所需溶液,特别是PH调节要check检查一遍。PAGE温度高,凝固快。
5, 上样,上样之前加入SDS loading buffer,还有CK+,CK-非常重要。
6, 电泳:20mAh两块胶一个半小时左右(根据目的蛋白大小调整),为了好看也可以适当调低。
7, 转膜:电泳结束前提前配置好转膜buffer,放入冰箱预冷,转膜一般条件是300mAh 1小时30分钟;350mAh是1一个小时。(这个条件适合转20-70kda大小的蛋白,如果目的蛋白过大或过小可以做相应的调整)
8, 封闭:5%脱脂牛奶封闭1小时,也可以选择更久,或者4度过夜。
9, 一抗:可以选择一抗(5%脱脂牛奶配置,一抗可以重复使用3-5次)4度过夜,换二抗时用TBST洗三遍,每次8分钟。
10, 二抗(5%脱脂牛奶配置):一个小时。
11, 显影:AB液混合好,覆盖至膜上,2分钟后可以进暗室拍照。
12, 以上8-9步换液体时不要直接倒在膜上。
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GMT+8, 2024-9-27 11:54
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