通道病理学( channelopathy ) 是当今国际学术发展中一门新兴学科。本文将针对有关电压门控钠通道的变异所导致的机体疾患, 如高血钾性周期性麻痹、先天性肌强直等骨骼肌疾患、LQT3、原发性心室纤颤等心脏病及其所涉及的钠通道突变体、通道的突变位点和电生理性质等一些研究资料与进展作一概括介绍。

关键词 电压门控钠通道; 通道突变体; 通道病理学

  电压门控钠通道是一类镶嵌在膜内的糖蛋白,在细胞动作电位的产生和传播过程中起着十分重要的作用。它通常由α、β1 和β2 三个 亚 基组成。α亚基为功能性单位,是由四个十分相似的结构域,  通过胞内连接环(loop) 相连而成(附图) 。每个结构域含有6个跨膜片段( S1 ~ S6)。其中S5和S6片段之间的连接环构成通道孔壁, 并决定着通道的离子选择性。S4 片段富含正电荷残基, 可充当通道的电 压感受器, 当膜电位去极化时可使S4片段跨膜移动,激活通道。当结构域 和 之间的胞内连接环堵塞通道孔的内口时, 便导致通道的关闭( 球- 链模型) [ 1] 。通道的基因突变会导致其相应的通道蛋白结构与功能异常, 进而诱发机体发生遗传性疾 病。近年来, 对于"通道病理学"的研究已迅速形成一门国际学术前沿新兴学科[ 2] 。本文将着重对有关电压门控钠通道α亚基基因的位点突变所引起的若干种遗传性疾病作一简要的概述。

  接环构成通道孔壁, 并决定着通道的离子选择性。S4片段富含正电荷残基, 可充当通道的电压感受器, 当膜电位去极化时可使S4片段跨膜移动, 激活通道。当结构域和之间的胞内连接环堵塞通道孔的内口时, 便导致通道的关闭 (球-链模型) [ 1] 。

图1 电压门控钠通道的结构 (a) 钠通道亚基的示意图。钠通道的a亚基被显示与b1和b2亚基相连接；b亚基的胞外结构域成免疫球蛋白样折叠，能与a亚基的包外环相互作用。罗马数字表示a亚基的不同结构域；S5和S6片段（用绿色表示）组成通道的孔区，螺旋S4片段（黄色）组成通道的电压感受器。蓝色的圆形表示结构域（Domain）III和IV的失活门IFM基序。P表示磷酸化位点（红色圆形表示蛋白激酶A的磷酸化位点，红色菱形表示蛋白激酶C的磷酸化位点），表示可能的N糖基化位点。每个结构域的重叠圆环表示构成离子选择性滤器的氨基酸（外侧环序列为EEDD，内侧环序列为DEKA）。(b) 溶液中电压门控钠通道a亚基在20 Å分辨率下的三维结构。(c) 细菌电压门控钠通道NaChBac的示意图。（Catterall et al. 2006）

通道的基因突变会导致其相应的通道蛋白结构与功能异常, 进而诱发机体发生遗传性疾 病。近年来, 对于"通道病理学"的研究已迅速形成一门国际学术前沿新兴学科[2] 。本文将着 重对有关电压门控钠通道 α亚基基因的位点突变所引起的若干种遗传性疾病作一简要的概述。

一、鉴别疾病基因的两种常用途径

( 一) 侯选基因途径( candidate gene approach) 疾病 →功能检测 →编码基因 →基因缺陷。 多数显性遗传通道疾病是由其通道蛋白功能的改变所引起。因此, 根据遗传病的生理学和生物化学特征可对其致病的主要基因加以鉴别。

( 二) 定位克隆途径 疾病 →遗传图谱 →侯选基因→功能。定位克隆途径已广泛用于疾病基因的鉴别。该法主要采用已知染色体位置的基因标记物对患者家族的疾病基因进行连锁 分析。一旦疾病基因所在的区域被鉴别后, 用基因作图法进一步缩小该区域; 然后通过物理作 图和克隆, 在通常为几百万碱基对的大范围 DNA中搜寻开放阅读框( open reading f rame) 以 及异常序列位置。该途径对隐性疾病基因如Cyst ic f imoss 的鉴别十分有效[ 3]。

二、骨骼肌钠通道疾病

成年人骨骼肌钠通道α亚基的编码基因一旦发生突变后可造成一组临床上症状相似的遗传性疾病, 如研究资料已证实人类染色体 17q23 位上钠通道α亚基SCN4A 基因突变可诱发高血钾性周期性麻痹、先天性肌强直病和非典型性肌强直病等[ 2~ 5]。

(一)  高血钾性周期性麻痹 HyperPP ( hyperkalemic periodic paralysis, 又称 Gamstorp’s disease 或 adymamia episodicahereditara) 是一种显性遗传性肌肉疾病。它的临床症状呈一过性 肌无力或麻痹。通常在运动后休息时发作或由摄入富钾食物造成血液中 K + 浓度升高所致。 临床上, H yperPP 病人在麻痹发作前往往会出现肌强直征兆。病人的麻痹性发作与血液中钾离子浓度升高相关。大多数 HyperP P 是由钠通道α亚基的 M1592V 和 T 704M突变所引起 的, A1156T 和 M 1360V 突变也可导致 H yperPP 的症状[3~7] 。T704M 位于结构域 S5 膜内 侧, M1592V 位于结构域 S6 的膜内侧,  这两个结构域中的 S5 和 S6 片段被认为参与了通道 失活化门控部件接受位点( receptor site) 的形成。

对HyperPP 病人活检肌肉纤维的电生理记录显示了一个持续的钠电流。该电流在低膜 电位状态( -70mV ) 下仍可被激活。虽然对 HyperPP 突变基因在哺乳动物细胞系中表达后进行了广泛的研究,  然而突变钠通道诱发骨骼肌麻痹的准确机制仍无定论。Cannon 和 Stt ritt M ef fer 曾报道[ 5] : 大鼠骨骼肌钠通道 M1592V 和 T 704M 突变体的异常失活化过程是由于短时程内通道开放次数和重复发放频率的增加所致。这一结果似乎与根据单个钠通道在快和慢门控方式之间自发切换的观察结果所提出的门控假说相一致, 并更倾向于慢门控机制。与此 相反, Cumins 等也对大鼠骨骼肌 T 704M 突变体进行了研究。他们发现突变通道活化的电压依赖性朝着负膜电位移动了 10~15mV , 而突变型与正常钠通道在快速失活化的动力学、电压依赖性或恢复过程等方面无明显差别。另据报道, 通道活化的电压依赖性改变会导致活化和失活化过程之间有重叠, 该重叠可在-70~ -35mV 电压范围内所能检测到的持续钠电流以及在病人肌纤维中观察到的去极化加以解释。肌纤维去极化将导致绝大多数正常钠通道失活化, 使得肌肉不能兴奋。此外, 外部 K+ 浓度升高可引起完整肌细胞和肌管中突变钠通道的功 能异常。相反, 在被分离的细胞膜片或异源细胞所表达的突变钠通道对膜外 K + 浓度不敏感, 提示 K + 可能通过改变膜电位的间接方式起作用。

( 二)  先天性肌强直病 (paramyotonia congenita,  P C 又称 Eulenburg’s disease) PC的临床症状特点是: 肌肉强直, 寒冷环境会加剧肌肉的僵硬程度, 被动的高强度肌活动会引起长时 期的肌无力。病人的肌强直症状不能通过肌肉活动得到缓解和恢复。PC 属于常染色体显性 遗传疾病,  与钠通道的 T 1313M 、L 1433R 、R1448H 、R1448C 和 A 1156T 等点突变有关。此外, A 1156T 突变也可产生兼有 HyperPP 和 PC 的临床症状[ 2~ 4, 6~ 8] 。

  T1313M 突变位点位于胞内涉及通道失活化门控装置的 ~ 结构域连接环上。该环如同铰链盖调控 通道的失活化 过程。其中由 IFM (1488~ 1490) 三联 残基如同铰 链盖,  由于 T 1313M 突变位点与 IFM 三残基相邻, 可能会减弱 IFM 盖与通道内口间的疏水作用, 造成通道失活化不完全, 进而诱发持续的较大钠电流。另三个突变点( L1433R、R1448H 和 R 1448C) 位于钠通道结构域 S4 或 S3 膜外口处。这些片段被认为是通道的电压感受器。

  将 PC 病人的肌纤维冷却到约 27 ℃后, 可诱发肌纤维膜的去极化以及产生自发动作电位和持续收缩。这一现象归因于钠通道的失活化异常而导致的持续内向钠电流。在哺乳动物细胞系中表达的 R1448H 和 R1448C 突变体显示钠通道的活化过程有细小改变, 且其失活化速率减慢, 而恢复速率则加快。单通道记录显示突变通道重复开放以及开放时间增加。这些特性与突变钠通道的开放和失活化状态间转换" 脱节"对应, 这将导致突变通道的活化和失活化过程之间部分解偶联。通道突变可能在一定程度上改变了其蛋白各构象状态的相对能量水平, 从而形成不同的失活化方式。

PC 和HyperPP 病人肌肉活检标本的电生理记录, 发现两者都具有钠电流失活化过程异常的共性。不同的是: 当河豚毒素(TTX) 敏感的持续钠电流引起较小的去极化膜电位和重复 发放的动作电位时, 可导致 PC, 而当持续钠电流引起较大的去极化膜电位, 使细胞失去兴奋 性时, 则可诱发HyperPP。

( 三) 钾离子恶化性肌强直病 ( K+-aggravated myotonia, PAM ) 其临床症状与 PC 十分相似。最显著特点是: 肌肉在静息后再活动时会出现僵硬症状。病人的肌强直症状不表现温 度依赖性, 但症状可被摄入的 K + 所加剧。PA M 曾被误诊为T homsen 肌强直病。但分子病理 学研究发现, PA M 与钠通道 SCN 4A 基因上的 S804F 、I1160V 、G1306E / V / A 或 V 1589M 突变有关, 而 T homsen 肌强直病与氯通道的 CLCN 1 基因有关。临床上 PAM 具有显著的 K + 依 赖性。S804F 点突变可导致兼有 PC 和 PA M 共同特点的临床症状[ 9,10] 。

  导致 PAM 的 G 1306E/ V/ A 突变位点也位于结构域连接环上。由于1306- Gly 的侧链很小, 使得整个铰链具有高度的弯曲灵活度。一旦 Gly 被其它大分子残基如 Ala、Val或 Glu 取代, 便会降低铰链的弯曲灵活性, 使得通道失活化受阻, 最终导致疾病的显露。例如, 比较在人胚胎肾细胞( HEK 293) 表达的 PA M 病变钠通道与野生型钠通道的电生理特性, 发现 G1306A 突变体只有 S1 值增加, 而 G 1306V 和 G1306E 突变体的失活化时间常数( S1 与 S2) 和 稳态电流与峰电流的比值( Iss/ Ipeak) 都明显增加, 且 G1306E 突变体的稳态激活曲线发生漂 移。由此表明, 在通道 1306 位点上残 基的分子越大, 电生理的异常活动越突出, 所对应的PA M 临床症状也越明显。

S804F 位于结构域S6 膜内侧, V1589M位于结构域 S6 片段的膜内侧, I1160V位于结构域S5膜内侧。这些片段均被认为是参与形成通道失活化门控部件的接受体。比较在 HEK 293 细胞中表达的 V1589M 突变体与野生型的电生理特性, 发现突变体的稳态电流与峰电流的比值( Iss/ Ipeak) 明显增加, 且失活化后的恢复过程明显加快 (其两个时间常 数 S1与S2变大) , 表明突变加速了通道由失活化态向关闭态与开放态的转换过程。

胞外K+浓度升高对 HEK 293 中表达的 V1589M 突变体和野生型钠通道的电流都没有影响。由此提示,K+ 浓度升高可能是通过间接方式加剧 PA M 的症状, 如胞外 K+ 浓度升高可诱 发细胞膜的去极化, 促发突变钠通道的电活动紊乱, 进而加剧了病人的临床症状。

( 四)  非典型肌强直病( atypicalmyotonia,  Am 或myot onia fluctuans )   Am 与 PAM 的临床症状几乎对应重叠。如肌肉僵硬、温度的非依赖性及由胞外 K + 浓度升高引起的影响等。同时, 造 成 Am 的病 因也 被归 结于 钠 通道 SCN 4A 基 因上 I1160V 、G1306E  / V / A 或V1589M 位点突变。A m 钠通道突变体的电生理记录也与 PAM 的相似。此外, 另一种被称之 为琥珀胆碱诱发的咬肌僵硬 ( masseter musclerigidity, MMR ) 病因也被认为是由于 SCN 4A 基因上的 G1306A 突变所致。尽管存在着上述种种雷同的迹象与因素, 然而, 在医学上划分 的 Am、PAM 和 MMR 是否归属同一病种似乎在现有文献中尚无统一的定论[ 11, 12] 。

( 五)  小鼠遗传性运动终板疾病( motorend plat e disease,  med) 和震颤疾病( medjo)目

前, 与小鼠 SCN 4A 基因突变相关的遗传性疾病尚未见报道。但小鼠 SCN 8A 基因内缺失突变导致相应钠通道不能表达, 可引起遗传性运动终板疾病[12, 13] 。其特征为: 肌肉消瘦、震颤、浦 肯野氏细胞退化, 造成机体的免疫缺陷以及幼年动物死亡。小鼠SCN8A基因仅在脑和脊髓中得以表达, 在骨骼肌和心肌中不表达。SCN8A 钠通道结构域 中位于连接 S4~S5 保守片段区域的 A 1071T 位点突变已被证实 可引起小鼠的震颤和运动失调( medjo) 。突变可使得通道的激活阈值增加, 浦肯野细胞的自发 活动降低, 进而造成小脑的抑制性输出减小, 导致动物对调控运动的功能丧失[ 14, 15]。

人类同源基因 SCN8A位于染色体 12q13上。尽管现在还没有发现与 SCN8A 基因相关的人类遗传疾病,但该基因现已被认为是人类遗传性神经退化疾病的候选基因。

三、心脏疾病

( 一)  第三类长 Q T 间隔症( LQT 3) 长 QT 间隔症( LQTs) 临床诊断的特征是:  心率失常, 心电图 Q T 间隔延长, 心肌细胞复极化异常。在正常生理条件下, 内向电流和外向电流之 间存在动态平衡。正常心肌细胞膜去极化后, 细胞的外向电流超过内向电流, 使膜复极化, 进而形成心肌动作电位平台。若心肌细胞存在持续的内向电流或细胞外向电流减小则可使动 作电位延长, 导致 QT 间 隔的延长, 引起 LQT s 。目前已鉴别到四种 LQTs 相关的基因座 ( loci) , 其中 3 个基因已被克隆:  2个为编码钾通道, 1个为编码钠通道[ 2]。

LQT 3是 LQT s病的第三类型, 可引起病人意识突然丧失, 癫痫发作, 甚至猝死。分子病理学研究表明: 位于染色体 3P21-24 上编码心肌钠通道 ( hH 1) SCN5A突变后可诱发 LQT 3[ 16~18] 。其突变部位被发现在:构成通道失活化门控部件的和结构域间连接环上缺 失了三个保守氨基酸残基(1505- Lys、1506-Pro 和1507-Gln) , 和各结构域中连接跨膜片段4 和5间的环上发生了 N1325S 和/或R1644H 点突变, 或结构域S4片段中R1623Q 点突 变。基因突变体可引起延迟钠电流增大, 使得膜去极化水平增加, 导致Q T间隔延长。电生理记录到爪蟾卵母细胞中表达的突变型钠通道的持续内向钠电流。该增大的内向钠电流被认为可能由两种异常的失活化方式形成: (1) 通道失活化态的稳定性降低, 进而加速了失活化后的恢复过程, 使得通道重复开放间隔缩短; (2) 通道失活化异常, 即由正常门控方式转换为爆发 性活动的门控方式,并延长其爆发性活动的持续时间。

( 二) 原发性心室纤颤 ( idiopathic vent ricular f ibrillat ion, IVF ) IVF 也是一种致命的心脏病。许多原发性心颤患者在第一次发病时猝死,  其主要原因是心跳陡然过速( 200~400 次/ min) , 且无规律, 导致心脏、大脑和整个机体供血紊乱。SCN 5A 基因被认为是诱发 IV F 的分子基础[ 19, 20]。诱发 IV F 的基因突变部位已被确证在三处: ( 1) 位于 结构域 S1 和S2 片段间 胞外连接环上的 R1232W 和位于结构域 S3和 S4 片段间胞外连接环上的 T1620M ; ( 2) 由于 在 SCN5A 基因内含子 7 的剪接供体部位添加了两个 AA 核苷酸, 使该基因的剪接过程遭到破 坏; ( 3) SCN5A 基因的 1397 位密码子缺失一个核苷酸 A, 使通道 结构域中 S6 片段部分, 结构域中 S1~S6片段部分直至通道蛋白的羧基端部分缺损, 导致符合阅读框的翻译终止。

电生理记录观察了爪蟾卵母细胞表达的野生型和突变型( R1232W+ T1620M) 钠通道的电活动性质。结果表明,二者的稳态激活电导 ) 电压曲线图无明显差异, 突变型的稳态失活化的电压依赖性比野生型向正膜电位方向漂移约 10m V。当电位恢复至约- 80mV 时, 突变 型比野生型通道的失活化后的恢复过程明显加快, 提示突变使得通道的失活化动力学发生了改变。SCN 5A基因突变虽是诱发 IV F 和 L Q T 3 的共同病因, 但两者间存在着一个明显的电 生理差异, 即当可诱发 IV F 的 SCN 5A 突变型基因( R1232W+ T 1620M ) 在爪蟾卵母细胞中表 达后,观察不到细胞的持续内向钠电流。在心电图上, IV F 病人具有右束支传导阻滞和 ST 段 升高的特征, 而 LQ T 3 病人的 Q T 间隔却显著延长。

诱发钠通道遗传性疾病的突变点似乎遍布于整个通道的序列, 且几乎均与通道的失活化 过程改变有关。附表归纳了钠通道突变与相关的机体疾患及其临床症状, 以及突变位点。

通过从基因水平研究钠通道遗传性疾病的分子基础,不但可加深对电压门控钠通道结构 与功能关系以及"通道病理学"的理解,同时为疾病的分类、诊断与治疗提供理论依据, 也为药物的"药理基因学( phamacogenet ic)"及其实际开发与利用奠定坚实的基础。

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本文见刊于生理科学进展1999 年第30 卷第4期