现代生命科学的发展改变着人们对生命获得过程的认识, 而离子通道的研究不仅与信号发生、传递、转导紧密关联, 同时也涉及到诱发各种遗传或非遗传性疾病的分子机制, 由此孕育出了“通道病理学”和“通道毒理和药理学”等新型学科。相对于Na+ 或Ca2+ 通道而言, K+ 通道更显示其多样性和复杂性, 而对Cl- 通道的研究也被日趋关注。现在从各种异源天然物种中寻求离子通道的特异性配体、探讨它们作为新药或生物试剂开发利用的可能性、并将它们作为“有效探针”推动相关靶通道受体的分子调控机理的基础理论研究已成为众多科学家们的艰巨任务[ 1]。以K+ 通道配体为例: 除verapamil、四氨基砒啶( 4-AP) 和四乙铵( TEA) 等一大类有机化合物外, 另一大类则是来自于蛇毒、蜂毒、蜘蛛毒以及蝎毒等天然肽类毒素. 其中短肽蝎毒素在近几年倍受重视, 其中部分具代表性的成员已被开发为国际生物试剂市场上用于研究K+ 或Cl- 通道的特异工具药物, 个别蝎毒素如Chlorotoxin 已成为研究原发性脑肿瘤细胞中的小电导Cl-通道独特配体。某些K+ 通道则直接用敏感的蝎毒素加以命名, 例如Charybdotoxin 敏感的K+ 通道( 即通常所指的大电导Ca2+ 激活的K+通道, BKCa ) 。以下从四个方面简述短肽蝎毒素及其结构与功能特征。

1 短肽蝎毒素的结构与功能特征

短肽蝎毒素一般由28~ 40 个氨基酸残基组成, 相对分子质量在2800~ 4500 之间, 分子内碱性残基占多数, 含有3 或4 对二硫键. 根据序列结构的同源性, 它们大致可被分成8 个组: 第一组以Charybdotoxin ( CTX ) 为代表, 成员主要包括Lq2、Iberiotoxin ( IbTX) 和LbTX 等. 其特征是在分子的第2 与第14 位上均分别座落着保守的Phe 和Trp 残基, 主要的靶受体是大电导钙激活的钾通道( BKCa ) [ 2] ; 第二组以Nox iustoxin ( NTX) 为代表, 主要包括Marg atox in ( MgTX) 、ClTX、TsKA和TyKA等[ 2] ; 第三组以Kaliotoxin ( KTX)

为代表, 主要包含Agitoxin 1 ( AgTX1) 、Agitoxin 2 ( AgTX2) 和Agitoxin 3 ( AgTX3) 等[ 3]; 第四组以Scyllatoxin ( Lei I) 为代表, 主要包含P05等, 特异作用于apamin 敏感的小电导钙激活钾通道; 第五组Maurotoxin ( MTX) 组, 主要包含Pi1、Pi2、Pi3 等, 分子含有与众不同的4 对二硫键[ 4]; 第六组以P01 为代表, 它们均由28~ 29 个残基组成, 是迄今发现最小分子的蝎毒素组; 第七组为TSK 毒素, 其分子主要特征是在C 端含有独特的-Cys-Asp-Cys-三肽结构. 以上一至七组的毒素均已被验证是选择性作用于各种钾通道的配体, 包括BKCa、小电导钙激活的钾通道( SKCa )、apamin 敏感或不敏感的以及其他各种类型的电压门控钾通道( Kv )。而第八组则以Chlorotox in ( ClTX) 为代表, 成员包括Be Ñ 1、Be Ñ 5、AmmP2 和Bs ò等, 其分子含有特征的-Cys-Cys-二联肽结构, 其中ClTX 已被证明是小电导的Cl-通道的阻断剂[ 5]; 第九组为imperatox in A( IpTXa) 短链蝎毒多肽, 它已被证明是骨骼肌型胞内ryanodine敏感的Ca2+ 释放通道激动剂, 其分子中也存在着特异的-Cys-Cys-二联肽结构[ 6]。

表1 简列了具代表性短肽蝎毒素的概况, 包括它们的一级结构、分类和功能特征. 但这种分类并不是绝对的, 各类毒素之间不论在结构上, 特别是在生物活性方面都有交叉重叠现象, 比如CTX 除作用于BKCa外, 还作用于淋巴细胞中的Kv , 果蝇shaker 的Kv , 爪蟾卵母细胞表达的A 型通道( KA ) 以及来源于Aplysia 的SKCa等; NT X 除了抑制Kv 外, 对钙激活钾通道( KCa )也有弱抑制作用; MTX 除了抑制shaker 钾通道以外, 还抑制apamin 和KTX 与大鼠脑突触体膜的结合. 空间结构研究表明: 这些短链蝎毒素多肽大都在C 端含

有两个B折叠, 靠近N 端有一个A螺旋, 一个B 折叠或一个延伸结构, 在含有3 对二硫键的短链多肽毒素中, 它们分别以1~ 4, 2~ 5 和3~ 6 的方式配对; 含有4 对二硫键的配对方式为1~5, 2~ 6, 3~4 和7~ 8. 目前已有二三十种短链多肽蝎毒素的空间结构被解析[ 7]。至于短链蝎毒素多肽的功能机制, 目前一般认为它们以其分布于分子表面的正电荷和靶通道分子膜外表面的负电荷通过静电作用结合, 产生抑制作用, 但不影响平均通道电导或改变单个通道的开放时间[ 2] .

2 短链蝎毒素多肽结构与功能的关系

目前主要通过三种途径对蝎毒素多肽结构和功能进行研究: a1 人工合成或基因突变的方法, 改变毒素配体特异的氨基酸残基或片段, 比较其前后生物活性, 研究毒素活性位点; b1 基因突变的方法, 改变其靶受体钾离子通道上特异氨基酸残基或片段, 研究毒素的作用机制以及在钾通道上的作用位点; c1 将毒素和钾通道的特异氨基酸残基同时改变, 探讨二者活性残基的相互作用关系。对CTX 的突变研究表明, 其C 端的B 折叠中几个碱性残基( Arg19、His21、Arg25、Lys27 和Arg34), 对毒素抑制BKCa的活性影响较大, 其中Lys27 影响最大, 突变成中性残基时,活性下降1 000多倍, 而其他部位残基的突变对活性影响不大[ 2] . 此区域的氨基酸残基在短链蝎毒素多肽中高度保守. 说明短链蝎毒素C 端的B折叠中的几个碱性氨基酸残基可能组成其活性中心. 另外对KTX 的C 端B折叠也进行了结构修饰和功能研究。结果同样证实了短链蝎毒素C 端保守残基是毒素与靶器结合的重要活性位点. 此外, 其他结构域的残基也参与了毒素的生物活性. 例如酰氨化的P05对apamin 敏感的SKCa具有明显的不可逆抑制作用, 而非酰氨化的P05 则对apamin 敏感的SKCa具有可逆的抑制作用[ 8], 说明酰氨基团可影响靶受体的选择性以及抑制可逆性。比较P05 组毒素的序列发现( 表1) , P05 与P01 的C 端残基很相似, 只在N 端区域有差异; 当比较它们与apamin 的序列结构时发现, apamin的C 端残基-RRCQ-在P05 中却位于N 端区域(-RRCQ-) , 而P01 中N 端相应位置却为-EDCP-。但P05 和apamin 对其敏感的SKCa抑制活性非常高( ~ pmol/ L )[ 9], 而P01 的抑制活性却很低( ~ μmol/ L) [ 3] . 这提示P05 N 端残基-RRCQ-结构域可能对其生物活性具有重要意义. 空间构象研究表明, P05 和P01都呈与其他类型短链蝎毒素相似的空间结构。以P05 为例, N 端A螺旋与C 端两个B折叠呈直角分布, 两个碱性氨基酸残基R6、R7分布在整个分子之外, 它们可能参与与靶受体的结合; 而P01的N 端A螺旋与C 端两个B折叠呈平行分布( 图1) , 相应的两个酸性残基D5、E4 伸出分子的空间结构之外, 这些酸性残基的存在可能会使P01 丢失生物活性, 但其邻近的碱性残基H9 可使它具有微弱的生物活性[ 9]。比较IbTX、CTX、KTX、NTX 等的生物活性发现, 它们对BKCa的抑制活性呈降低趋势, 而对Kv的抑制活性呈趋高走势[ 10] . 观察它们的一级结构, 只对BKCa有抑制活性的IbTX, 其N 端A螺旋上没有Pro 残基, 而其他三种则都含有Pro 残基。提示此Pro 残基可能会改变毒素的空间构象, 进而影响其生物活性的选择性. 另以CTX 和KTX 为例, CTX 中N 端区域和A螺旋结构域分布于C 端两个B折叠的一侧; 而在KT X 中, 由于Pro12 使得其A螺旋缩短, 造成N 端区域的延长, 使得N端区域和A螺旋结构域分布于C 端两个B折叠的两侧( 图2)[ 10], 这就在分子结构的水平上解释了CTX 对BKCa较之Kv 的更强作用, 而KTX 的作用则与CTX 相反. IbTX 中不含Pro 残基, 它只对BKCa有抑制活性, 而NTX 则只对Kv 有抑制活性.另一方面, 许多在N 端A螺旋区域含有Pro 残基的毒素, 如MgTX、TsKA等, 都表现出对Kv 的高抑制活性[10] . 因此Pro 残基对短链蝎毒素的选择特性具有重要作用。

综上所述, 在短链蝎毒素的结构与功能研究中, C 端B折叠中的碱性氨基酸残基可能是其生物活性中心或者是其与靶受体的结合位点, 但其生物活性还需其他结构区域的参与, 其中三对二硫键维持的N 端A螺旋和C 端两个B 折叠所组成的稳定空间构象是维持其生物活性的前提。

3 短肽东亚钳蝎毒素

东亚钳蝎( Buthus mart ensi K arsch, BmK)广泛分布于中国西北、蒙古和朝鲜等地区, 一般认为不具致死的能力, 但有相当的毒性. 对东亚钳蝎毒素的研究结果表明, 其粗毒除含有特异作用于Na+ 通道及Ca2+ 通道的主要配体外[11, 12] , 还含有特异作用于K+ 通道的配体[ 13]. 最近七种BmK 短链蝎毒素已得到了分离纯化[ 3, 14]. 结构同源性比较提示, BmKT X 属于KTX 组, BmKTX1 和BmKTX2 属于CTX组, BmP01、BmP02、BmP03

属于P01 组, 而BmP05 则归属于Lei 组( 表1)。它们在粗毒中均含量甚微[3]。 通过标记和电生理实验表明, BmKT X、BmKTX1和BmKTX2 均能抑制卵母细胞表达的Kv113;BmKTX1 和BmKTX2 可抑制牛血管肌浆网膜的BKCa[14] ; 而BmP02、BmP03 似乎对Apamin 敏感的K+ 通道仅有微弱的抑制效应[ 3]。近来我们组经改良生化手段获得了两个高得率的小分子活性肽BmP02 和BmP03 ( 得率分别为0145%、0143%) , 鉴定并分析了它们对成年大鼠心室肌细胞短暂外向钾通道的阻遏电生理效应及其作用机制[15]。有关BmP02 的NMR 空间构象图谱解析工作正在进行中。

4 短链蝎毒素作为探针对钾通道的研究

许多短链蝎毒素作为特异有效的工具药物已被广泛地应用于钾通道结构和功能的研究, 包括发现新型的钾通道、探讨钾通道的生理功能、分类以及相互间的分子进化亲缘关系; 通道的门控特征、激活、失活和恢复动力学特征; 配体与通道结合的分子基础等. 如MacKinnon 等[ 16] 成功地利用CTX 作为探针证明了shaker 钾通道四个亚基中只有一个亚基具有完整的/ 失活门0. 此外, 他们以蝎毒素AgTX2 为探针, 利用亲和层析和标记结合实验技术, 证实了原核生物和真核生物的钾通道结构上具有很高的保守性[ 17] . 随着研究的深入, 短链蝎毒素将如同apamin, dendrodotoxin ( DTX ) 一样[ 18, 19] , 作为有效工具药被广泛地应用在靶离子通道结构和功能的研究中, 体现出不可低估的学术价值与应用前景。

本文已见刊《生物化学与生物物理进展》 2001,28（1）