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QIIME 2教程之Barcode拆分和去除引物
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在数据量比较小的情况下，dada2（deblur）分析的输入数据最好提前将barcodes和引物这些不想要的adapters切除，虽然dada2（deblur）也能粗略切除barcodes和引物，但是做不到cutadapt插件那样精细。
【备注】
虽然可在dada2(deblur)步骤时设置合适的参数去除引物(论坛里建议在使用dada2处理数据之前先去掉引物）。
Dada2方法要求的输入测序数据必须是已经拆分样本（类似qiime1裂库）的测序数据，这个测序数据也必须是带质量信息的。
（一）区分样本的带质量信息的单端/双端测序数据
国内目前大多数公司给的测序数据形式都是这个，每个样本两个fastq文件，一个放正向序列，一个放反向序列（单端测序只有正向）。要是每个样本两个fasta文件（序列的质量信息已被删除）呢？不好意思，qiime2处理不了这种数据，当然你也可以写个脚本（如python），把序列的质量信息都填充成高质量值（既然已经经过质控，生成fasta，那么我们就可以假设这些序列的质量值都很高了），伪装成fastq文件，这样也能用下面的步骤导入，不过fasta最好还是用qiime1分析。要是双端测序数据一个样本只有一个文件（正向序列和反向序列没有分开放）呢？那你也可以写个脚本（如python）根据序列头的“1”和“2”来把正向序列和反向序列拆开，再用下面的步骤导入。这里，我们只提供大多数情况（每个样本两个fastq文件）的处理步骤：（1）建立一个manifest文件，这个文件公司不会给你的，你需要自己手动书写。（2）单端/双端测序数据和manifest文件，导入数据。
因为已经按样本拆分好数据，所以一般此类型数据中不存在barcodes。导入数据后，直接后续去除引物，序列质控和生成特征序列和特征表。
【备注】
详见：《QIIME 2教程之数据导入》 (三)任何其他类型的fastq数据（科学网—QIIME 2教程之数据导入（importing data） - 刘树青的博文 (sciencenet.cn)）
（二）不区分样本的带barcodes、带质量信息的单端/双端测序数据
其实目前国内很多公司给的应该是区分样本（不同样本的序列放在不同文件里）的带barcodes和引物的fastq测序数据，这种情况你可以用（一）中的方法导入，再用dada2 --p-trim-left参数大致切一下barcodes和引物（deblur --p-left-trim-len）；或者你可以选择稍微精确一点但是费事一点的方法，先把所有样本的序列合并到一个文件（如果双端，正向、反向文件分开合并），再用下面的方法完成数据导入,barcode拆分样本，去除引物。
以下类型（Multiplexed*），主要适用于不区分样本的，所有样本测序数据放在一个文件，没有切除barcodes和引物（如果是双端测序数据，则正向、反向分开，只有正向序列fastq里有barcodes）的数据。
数据导入类型：
MultiplexedSingleEndBarcodeInSequence | 单端 |
MultiplexedPairedEndBarcodeInSequence | 双端 |
单端数据
1. 准备测序数据
没有拆分的单端数据放到一个目录：fastq/，分别命名为：forward.fastq.gz
metadata.tsv：
sample-id Barcode Lin027 GATCTGCA Lin028 GATCTGCA Lin029 GATCTGCA Lin032 GATCTGCA Lin033 GATCTGCA |
2. 数据导入
qiime tools import \ --type MultiplexedSingleEndBarcodeInSequence \ --input-path fastq/ \ --output-path multiplexed-seqs.qza | --input-path 单端数据的路径 |
3. cutadapt插件区分样本，并去除barcode序列
qiime cutadapt demux-single \ --i-seqs multiplexed-seqs.qza \ --m-barcodes-file metadata.tsv \ --m-barcodes-column Barcode \ --o-per-sample-sequences demultiplexed-seqs.qza \ --o-untrimmed-sequences untrimmed.qza | --i-seqs指定的是上一步的输出， --m-barcodes-column指定的是metadata.tsv中，barcodes在所在列的列名。 demultiplexed-seqs.qza这个文件是拆分好的数据，并且已经去掉了barcode序列。 |
4. 去除引物
qiime cutadapt trim-single \ --i-demultiplexed-sequences DemuxSeq.qza \ --p-front CCTACGGGNGGCWGCAG \ --o-trimmed-sequences trimmed-seqs.qza | --p-front指定引物 |
双端数据
1. 准备测序数据
没有拆分的双端数据放到一个目录：muxed-pe-barcode-in-seq，分别命名为：forward.fastq.gz reverse.fastq.gz
sample-metadata.tsv：
sample-id forward-barcodes reverse-barcodes Lin027 GATCTGCA CTACGATG Lin028 GATCTGCA GACATAGC Lin029 GATCTGCA GATCTGCA Lin032 GATCTGCA GCGTATGA Lin033 GATCTGCA GTATGCGA |
2. 数据导入
qiime tools import \ --type MultiplexedPairedEndBarcodeInSequence \ --input-path muxed-pe-barcode-in-seq \ --output-path multiplexed-seqs.qza | --input-path 双端数据的路径 |
3. cutadapt插件区分样本，并去除barcode序列
qiime cutadapt demux-paired \ --i-seqs multiplexed-seqs.qza \ --m-forward-barcodes-file sample-metadata.tsv \ --m-forward-barcodes-column forward-barcodes \ --m-reverse-barcodes-file sample-metadata.tsv \ --m-reverse-barcodes-column reverse-barcodes \ --o-per-sample-sequences per_sample_sequences.qza \ --o-untrimmed-sequences untrimmed_sequences.qza | per_sample_sequences.qza 这个文件是拆分好的数据，并且已经去掉了barcode序列。 |
4. 去除引物
qiime cutadapt trim-paired \ --i-demultiplexed-sequences demux.qza \ --p-front-f CCTACGGGNGGCWGCAG \ --p-front-r ADAPTER2SEQUENCE \ --o-trimmed-sequences trimmed-seqs.qza | --p-front-f指定正向引物， --p-front-r指定反向引物， 【注意】不要用--p-adapter-r或者--p-adapter-f参数，它们匹配的是3’末端的序列。 |
（三）EMP未区分样本、带质量信息的单端/双端测序数据
EMP类型是未区分样本、带质量信息的测序数据，需要先barcode拆分。拆分之后，直接后续去除引物，序列质控和生成特征序列和特征表。
【备注】
拆分样本之前，原始序列文件中的序列已经不带barcodes，所以拆分样本之后，也不带barcodes。
详见：《QIIME 2教程之数据导入》 (一)采用地球微生组计划(EMP)标准方法产生的FASTQ格式数据（科学网—QIIME 2教程之数据导入（importing data） - 刘树青的博文 (sciencenet.cn)）
【参考】
adapter | 接头，为一段已知的短核苷酸序列，用于链接未知的DNA fragment。 adapter不是一段特定的序列，index＋引物＋P7/P5也就是由DNA fragment增变为最后待测序列，在两端增加的序列，总称为adapter。 |
index或barcode | 几个碱基组成的寡核苷酸链，用于在混合测序时，区分不同样本 |
insert | DNA fragment，位于两个adapter之间 |
Index 序列 | 可根据fastq序列中的信息获取，一般长度为6nt。 @HWI-ST1276:71:C1162ACXX:1:1101:1208:2458 1:N:0:CGATGT fastq的格式信息不再赘述，第一行最末的 CGATGT 即本次测序所使用的index。 |
如何利用qiime2对barcode信息拆分数据 - 开发技术 - 亿速云 (yisu.com)
2018-04-17宏基因组实战qiime2-201802（三）去除引物和Barcode - 简书 (jianshu.com)
技术贴 | 16S专题 | 基于QIIME2 dada2插件的16S扩增子测序数据的分析流程详解（中） (360doc.com)
https://blog.sciencenet.cn/blog-994715-1364532.html
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