在英国科学家道尔顿和意大利化学家阿莫迪欧·阿伏伽德罗先后在1803和1811年提出原子和分子学说后，直到1911年法国科学家佩兰通过布朗运动实验才第一次证明了分子的存在1。在那时佩兰就曾试图通过肉眼在显微镜下观测单个荧光分子，但是由于受限于但是得实验条件的（人眼的灵敏度，光源，显微镜以及各种光学元器件）该实验并未成功。自此之后人们相信单个分子的荧光信号太弱而不可能被观测到。但是人们并未停止尝试观测和研究单个分子。直到上世纪50年代，随着电子显微镜的发展，单排的原子可以被观测到，但是由于分辨率太低而且电子束对样品损伤严重，此时的电子显微镜并不适合去观测单个分子。随着上世纪80年代扫描隧道显微镜和原子力显微镜的问世2,3，在表面上检测单个原子或分子终于成为可能。这两项技术为开辟了现代科学对微观世界的研究，并成为当前研究纳米科学的常规手段。

要实现对单个分子的光学检测，首先分子的荧光信号必须足够强能够被探测到，而且分子周围的背景光必须足够弱使得分子与背景有足够的对比度。在上世纪70年代，人们成功实现了在气相中对单个原子的检测。当原子经过激光束时会被激发而发射共振荧光，通过检测该荧光信号而实现单个原子的检测。在气相中，原子周围的是真空状态，所以在没有原子时基本没有背景光，当一个原子进入激发光区域被激发后，只要探测装置足够灵敏即可以实现单个原子的探测。但是该技术不不能直接应用到固相或液相中的单分子检测。因为首先在固相或液相中目标分子往往被大量溶剂或其它介质分子包围（在显微镜聚焦光斑的体积内约有十的九次方个溶剂分子），这些分子都会对激发光进行散射（瑞利散射），从而造成非常强的背景光，而目标分子或原子往往被淹没在这些散射光中而无法被探测到。因此在固相和液相体系中必须通过分子的荧光发射，结合适当的滤光片选择性的对目标分子的荧光进行探测才可能实现单个分子的探测。当然除了瑞利散射外，溶剂或介质分子往往会后拉曼散射，虽然相对于荧光来说拉曼散射的强度较低，但是由于分子数量上的巨大差距，拉曼散射也为单分子荧光检测造成一定困难，因此即使在现在的技术条件下只有量子产率较高的荧光分子才可以实现单分子检测。

直到80年代末，随着探测设备灵敏度的提高，激光技术以及各种光学元件的发展，通过共聚焦显微镜已经可以将激光束聚焦于亚微米尺度，这使得背景杂散光和杂质的影响大大减弱，终于W.E. Morner等人第一次在液氦温度下探测到单个分子对激光束的影响，从而第一次实现在固相中单个分子的光学检测4。第二年，M. Orrit等人同样在液氦温度下通过探测分子的荧光第一次实现了单分子荧光检测5，也开辟了单分子荧光光谱技术的崭新领域6。随后单分子荧光光谱技术被进一步扩展到室温和液相体系，被广泛应用的各个领域特别是生物研究7–9。目前单分子荧光显微镜已经成为实验室常规手段之一，并且结合各种光学参数扩展出基于不同光学属性的显微技术例如单分子荧光寿命成像，单分子偏振光谱，单分子相位成像等技术。由于受到衍射极限的约束，常规光学显微镜分辨率一般为几百纳米，目前多个研究小组已经通过不同手段突破衍射极限的实现超高分辨率（几十甚至几个纳米）10–12。

第二节 分子荧光光谱原理

对于多原子分子，不同的分子轨道对应于不同的外层电子结构。这些分子轨道在能量上是不连续的，通常情况下电子处于最稳定分子轨道上即分子的基态，当与光子发生相互作用后，分子会吸收光子的能量，跃迁到较高的能级——激发态。当分子处于相对不稳定的激发态时会自发通过释放能量返回基态。其释放能量的途径一般分为辐射跃迁和非辐射跃迁。所谓的非辐射跃迁只分子通过振动弛豫等途径返回基态，多余能量通过热能传递给周围介质。而辐射跃迁即分子通过发射一个光子来释放能量，我们称该过程为荧光发射，通过荧光发射发出的光称为荧光。

第三节 单分子荧光原理

单分子荧光的基本原理就是将分子与分子区分开，并对每一个特定分子的荧光进行探测和研究。要将成千上万个分子分开主要有两个主要途径：首先可以从空间上进行区分，这也是目前室温下单分子研究最常用的手段，也就是将荧光分子的溶液进行无限稀释到约10-12摩尔每升，然后旋涂到基片上，通过这种方法，将有少量荧光分子停留在基片上，它们之间的距离大于激发光的衍射极限后就可以通过荧光显微镜将它们区分开13；另一种办法是通过光谱分辨，低温单分子荧光光谱通常用光谱分辨的方法来实现，当分子处于液氦（4.2 开尔文）或更低的温度下，分子的振动被降至最低，分子的光谱也相应的变的非常窄，处于晶体里的荧光分子吸收光谱一般为几十兆赫兹（即10-5~10-4纳米），而且由于单个分子对于周围环境非常敏感，不同的分子光谱位置在几十兆赫兹的尺度下并不相同，因此如果所选用的激发光同样非常窄（几兆赫兹），那么即使荧光分子的浓度相对较高时，在衍射极限光斑中存在多个荧光分子，也可以通过调整激发光的波长来选择激发其中的某一个从而实现单个分子的检测和研究6。除此之外，实现单个分子的光学检测还有其他一下重要的要求：一、足够的检测灵敏度。单个分子的荧光强度非常弱，在低温下非常稳定的单个分子的每秒最多也只只能发射大约~105个光子。在室温下由于分子的稳定性以及激发效率等因素，单个分子每秒大约只能发射103~104个光子，因此如果检测效率不高，几乎无法探测到单个分子的荧光。较好的检测效率取决于显微镜的透镜、光学元件质量、光路设计搭建以及探测器探测效率。

第四节 单分子荧光光谱优势

单分子技术的优势主要分两个方面：首先，常规的光谱技术通常对样品溶液或固体进行测量，所得结果是所有样品分子的平均值，但是其中并非所有分子都完全相同。因此只有对单个分子逐一分析测量后，才能得到相对详细和准确的了解。单分子技术对于这种有个体差异的体系来说是非常有效的手段。其实即使均相体系，在单分子层面上来讲，每个分子的行为也不尽相同，表现出不同的性质；其次，大量样品的平均后结果往往在时间上比较稳定，因此即使分子在发生动力学变化，由于所测结果是大量分子的平均结果，动力学变化则往往隐藏在这种平均值中而不能被观测到。但是单分子技术可以实现在时间上对某个特定分子的跟踪研究，从而得到其动力学过程，这对于分子动力学，特别是生命过程机制研究非常很重要。当然由于信噪比的限制，单分子荧光随时间变化曲线的时间分辨率往往不高，一般为毫秒级到分钟级。当然通过单光子技术可以得到荧光寿命的信息，但是这却是长时间的统计结果。