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CD的理论
圆二色谱(CD)测量分子在溶液中,通过光学的吸收左和右旋圆偏振光的光,是一种提供分子信息的技术。 CD信号中观察到相同的光谱区的吸收带的特定化合物,如果各自的发色团的化合物或分子的环境是不对称的。蛋白质的 CD信号主要发生在两个光谱区。远紫外或酰胺的区域(170-250 nm)的贡献占主导地位的的肽键,而在近紫外区(250-320纳米)的CD信号来源于芳香族氨基酸。此外,二硫键产生轻微的约250纳米的CD信号。的两个主要光谱区给出不同的种关于蛋白质结构的信息。蛋白质的二级结构:无规卷曲,螺旋 折叠
CD仪器使用很高能量的灯,可以使氧电离成为臭氧。臭氧有一定的毒性,而且能够快速损坏仪器中光学系统的镜子。CD仪器在使用前必须充氮气,赶走氧气。仪器在使用的整个过程中,都必须在氮气氛围操作。
蛋白质的浓度通常用紫外可见光谱仪测量。称重的方法是不行的。即使是很高纯度的蛋白质样品,在生产过程中都会盐成分的加入,而且比例不低。比如1000毫克蛋白质样品,蛋白质为680毫克,盐300毫克,其他杂质蛋白20毫克。这个样品的蛋白质纯度高达97%以上,算是不错的样品,但是如果按重量算,它的纯度只有68%
CD光谱和结构转型的实验测量指南
最好只用石英比色皿,因为它有高透明度,不是双折射,应该可被使用。CD比色皿彻底清洗干净后,单独测量比色皿,应该得到没有发生偏差仪器的基线。如果痕迹的杂质,例如残余的蛋白质,留在玻璃表面上,就回造成基线问题。溶解样品的缓冲液和它的盐的总吸光度的贡献,应尽可能小。这造成了CD的测量严重的限制,特别是在远紫外区域的溶剂选择。因此,盐和缓冲液的吸光度值,必须确定在远紫外区域之前的测量。普通的变性剂如尿素和胍氯化强烈的吸收,这限制了它们的使用在远紫外区域以上波长210纳米。只有高纯度的盐和变性剂才能被使用,以避免干扰。氧气吸200nm以下的收光,这使得有必要使用脱气溶剂。电池隔室和光学系统的仪器应该用氮气置换。以下的考虑是重要的蛋白质浓度的最佳选择:路径长度和溶剂的条件。一个很好的信号与噪声的比例是实现时的吸光度为1.0左右,但一般来说,它应保持低于2.0。CD的信号大小依赖于蛋白质的浓度,并因此其贡献的总的光密度的样品应该尽可能高。这意味着,所用溶剂的吸光度应该尽可能的小。应记录到CD实验前的样品的吸收光谱以确定的计算中所必需的蛋白质的浓度的摩尔CD和选择的CD测量的最佳条件。大多数缓冲区在近紫外区域中是透明的,和路径长度的1厘米或以上可以选择在这个光谱区域。测量的远紫外区,短路径长度(0.2-0.01厘米),并增加蛋白质含量应以最小化的溶剂的总吸光度的贡献。如规则,0.1厘米比色皿可以用于的光谱区域下降到200nm。为了测量200nm的下方延伸,0.01厘米的细胞是可取的。解决方案是用于CD测量应过滤或离心分离除去灰尘或其他固体悬浮颗粒。当蛋白质样品一个扩展的时间暴露于大约220纳米的UV光,是经常出现的时测量的远紫外CD光谱和构象转变动力学的情况下,对研究蛋白质变性很有帮助。
1 打开氮气源,在开启仪器之前给光学部件充满氮气至少20分钟
2 打开控制灯温度的水循环系统。
3 在开启CD仪器和计算机之前,点亮灯。切记:点灯会产生瞬间高电压脉冲,足可以损坏已经运行的仪器的电子元件和计算机。
4 开启CD仪器和计算机,并且开始CD实验软件程序。
5 设置实验温度
6 进行测量
近紫外CD光谱代表了蛋白质自然状态的高灵敏度的标志,它通常能被用来作为正确折叠构象的指纹。螺旋蛋白质有很强的CD吸收峰,最低值在222和208纳米,最高点在195纳米。折叠蛋白质则显示一个较弱的曲线,只有一个最低点在217纳米左右。如果一个蛋白质既有螺旋又有折叠,CD光谱则主要由螺旋决定。无结构蛋白质和多肽在210纳米以上几乎没有信号,但在195纳米左右有一个巨大的负吸收峰。
测量CD光谱时,我们必须仔细选择溶剂和缓冲液。来自缓冲液和盐的总吸收尽可能控制到最小。这些要求使得CD实验的样品配制受到很严格的限制,因为通常使用的缓冲液和盐在近紫外区域都有很强的吸收。通常的变性剂如尿素和盐酸胍也在这个区域有很强的吸收。因此它们不能用于低于210哪米的CD测量。仅从CD仪器测量要求来看,纯水是最理想的蛋白质溶剂,但是,实际操作中,许多蛋白质在纯水是不够稳定的,另外研究去折叠和结合实验中,还是需要缓冲液的。所以,我个人的经验是:用低盐的缓冲液作为CD实验的蛋白质溶剂。
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