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圆二色散仪 (Circular Dichrosim)

已有 7009 次阅读 2013-6-15 11:53 |个人分类:评论|系统分类:科研笔记

CD的理论

圆二色谱(CD)测量分子在溶液中,通过光学的吸收左和右旋圆偏振光的光,是一种提供分子信息的技术。 CD信号中观察到相同的光谱区的吸收带的特定化合物,如果各自的发色团的化合物或分子的环境是不对称的。蛋白质的 CD信号主要发生在两个光谱区。远紫外或酰胺的区域(170-250 nm)的贡献占主导地位的的肽键,而在近紫外区(250-320纳米)的CD信号来源于芳香族氨基酸。此外,二硫键产生轻微的约250纳米的CD信号。的两个主要光谱区给出不同的种关于蛋白质结构的信息。蛋白的二级结构:无卷曲,螺旋 折叠

                     

CD器使用很高能量的灯,可以使氧离成臭氧。臭氧有一定的毒性,而且能快速器中光学系子。CD器在使用前必充氮气,赶走氧气。器在使用的整个程中,都必在氮气氛操作。

蛋白度通常用紫外可谱仪测量。称重的方法是不行的。即使是很高度的蛋白质样品,在生产过程中都会成分的加入,而且比例不低。比如1000毫克蛋白质样品,蛋白质为680毫克,300毫克,其他杂质蛋白20毫克。品的蛋白质纯度高达97%以上,算是不品,但是如果按重量算,它的度只有68%


CD型的实验测量指南

最好只用石英比色皿,因它有高透明度,不是双折射,应该可被使用。CD比色皿底清洗干后,量比色皿,应该得到没有生偏差器的基线。如果痕迹的杂质,例如残余的蛋白,留在玻璃表面上,就回造成基线问题。溶解品的冲液和它的吸光度的献,尽可能小。造成了CD重的限制,特是在紫外区域的溶剂选择。因此,冲液的吸光度,必确定在紫外区域之前的量。普通的如尿素和胍烈的吸收,限制了它的使用在紫外区域以上波210米。只有高度的才能被使用,以避免干。氧气吸200nm以下的收光,使得有必要使用脱气溶池隔室和光学系应该用氮气置。以下的考是重要的蛋白质浓度的最佳选择:路径度和溶的条件。一个很好的信号与噪声的比例是实现时的吸光度1.0左右,但一般来,它保持低于2.0CD的信号大小依于蛋白度,并因此其献的的光密度的应该尽可能高。意味着,所用溶的吸光度应该尽可能的小。应记录CD实验前的品的吸收光以确定的算中所必需的蛋白度的摩CD选择CD量的最佳条件。大多数冲区在近紫外区域中是透明的,和路径度的1厘米或以上可以选择个光区域。量的紫外区,短路径度(0.2-0.01厘米),并增加蛋白含量以最小化的溶吸光度的献。如规则0.1厘米比色皿可以用于的光区域下降到200nm200nm的下方延伸,0.01厘米的胞是可取的。解决方案是用于CD应过滤或离心分离除去灰或其他固体粒。当蛋白质样品一个展的时间暴露于大220米的UV光,是常出时测量的紫外CD和构象转变动力学的情况下,研究蛋白质变性很有帮助。

1 打开氮气源,在开启器之前光学部件充氮气至少20分

2 打开控制灯温度的水循

3 在开启CD器和算机之前,点亮灯。切:点灯会生瞬电压脉冲,足可以坏已运行的器的子元件和算机。

4 开启CD器和算机,并且开始CD实验软件程序。

实验温度

6

近紫外CD代表了蛋白自然状的高灵敏度的志,它通常能被用来作正确折叠构象的指。螺旋蛋白有很CD吸收峰,最低在222和208米,最高点在195米。折叠蛋白质则显示一个弱的曲线,只有一个最低点在217米左右。如果一个蛋白既有螺旋又有折叠,CD谱则主要由螺旋决定。无构蛋白和多在210米以上几乎没有信号,但在195米左右有一个巨大的吸收峰。

CD谱时,我细选择冲液。来自冲液和吸收尽可能控制到最小。些要求使得CD实验品配制受到很格的限制,因通常使用的冲液和在近紫外区域都有很的吸收。通常的如尿素和酸胍也在个区域有很的吸收。因此它不能用于低于210哪米的CD量。CD量要求来看,水是最理想的蛋白,但是,实际操作中,多蛋白水是不够稳定的,另外研究去折叠和实验中,是需要冲液的。所以,我个人的经验是:用低冲液作CD实验的蛋白




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