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一个大分子结构的测定赋予人们来了解和影响生物过程的方式是无与伦比的,同时又给不同的研究领域----从机理研究到药物开发----带来清晰理念。结构生物学的学科起源于半个世纪以前,带给了了解生物学的初步的动力来源。并且推动了转变观念:生物学的根是分子,必须用分子和物理化学的语言进行理解。活跃在中国科研一线的著名科学家如施一公,饶子和,孙飞,施蕴渝,唐淳,王大成,常文瑞,许瑞明,朱平,柳振峰,丁建平,周界文,雷明等不胜枚举,他们都是从事结构生物学研究的。
对X射线晶体衍射,获取合适的晶体是生物大分子结构分析的最大的障碍。其中最重要的和最必需的标准是,晶体必须能够衍射X-射线,允许建立一个可靠的原子层次上的模型。影响成核和晶体生长的的参数是理论和实验研究的主题。寻找合适的缓冲液,沉淀剂,添加剂,和用于结晶的温度越来越多地被系统研究,采样条件的这些变量已被纳入一些商业结晶套件的设计中。机器人可以被用于蛋白质样品的结晶条件筛选的繁琐的实验室工作当中。单个残基的突变和表达域,截短的序列,或消除部分片断的序列往往可以产生全长或野生型抵制一切尝试的蛋白质结晶。
在现代同步加速器设施,可以在分钟时间尺度得到的常规问题的完整的数据集。X射线照射会使蛋白质化学键断裂,照射溶剂所产生的自由基种如(OH•)可以和蛋白质反应,从而导致结晶度的损失和分辨率的降低。在约100 K用闪式冷却结晶中的固定化,最大限度地减少了自由基反应。装置的发展和抗冻剂等试剂运用为低温度数据的采集提供了方便,帮助结构生物学的革命化进步。结构分析的结果是一个3-D的电子密度图,这是由富里叶变换计算的X散射的结果。这种计算不仅需要测量散射X射线的振幅(平方根的强度),同时也需要确定所有的反射波的相位。这些相位不被X衍射实验确定。通常用,多同晶置换(MIR)和多波长异常衍射(MAD)这两种策略来确定新的或未知的蛋白质折叠的结构分析。在这两种策略中,增加了重的原子或硒蛋氨酸的贡献被用来计算通过三角测量的蛋白质的相位。在测定所使用的相位而计算的初步实验的电子密度图,它可以是从同晶更换和反常散射得到的数据的有利的组合。要求大部分溶剂地区有统一的电子密度(溶剂扁平化)是一个有用的限制,提高了的相位精度。内置的电子密度图使用原子模型互动和菜单驱动的图形显示,可以构建最初的原子模型。互动拟合实验电子密度图构建的最初的原子模型通常是不完整和不准确的。他们可以作为开始点进行优化,这是一种过程,其中由调整原子的位置和热物性参数来改善观测和计算结构因素之间的一致度。使用修改后的参数依次计算相位和新的点子图,允许模型优化,并添加缺少的部分。这循环的过程被重复,直到不能进一步优化。目前台式机的计算能力允许非晶体学的研究人员能够显示和分析已存放在蛋白质数据库的结构数据。可用的程序的特别有用的功能,是可以比较结构的构象的异同,方便非共价相互作用的分析和突变模型的建立,以产生在各种风格的蛋白质图象。
核磁共振的发展史,是一个科学史上的经典范例。在多次的山穷水尽之后,又出现了柳暗花明。最早PAULI提出了核子自旋的假设,经过RABI等人实验证实其存在,到1945年PURCELL和BLOCH以共振法测定了核子自旋,真正打开了核磁共振的大门。这之后的15年,核子自旋与环境因素之间的相互作用理论,核磁弛缓原理及化学位移现象相继建立和发现,傅立叶转换原理也用于了核磁共振上。但到了60年代末期,一般人认为核磁共振理论研究走进了死胡同,可很快在70年代,JENEER提出,EREST发展了二维核磁共振理论,磁共振成象也在医院里应用发展起来了。固态核磁共振也快速发展起来了。80和90年代以WUTHRICH为先驱的科学家用核磁共振光谱法解析了蛋白质在溶液中的结构。现在核磁共振仍然在理论和实践中都在发展。核磁共振由一个物理学家好奇探索的现象,而成为理工农医众多领域广泛应用,甚至是不可缺少的先进技术。它的成就,再一次证明了基础科学研究的重要性。值得一提的是核磁共振发展过程当中几位重量级人物BLOCH,EREST和WUTHRICH都来者瑞士。固态核磁共振领域大师级人物SEELIG教授讲过一个有趣的故事,他在读博士选导师的时候,曾经有几位导师可以选择,有德高望重的老教授,有年富力强的新学者。他最后选择了当时还不满40岁的EIGEN作为导师。而EIGEN在40岁时就获得了NOBEL奖。SEELIG后来到美国做博士后,也选择了年轻的MCCONNEL,而后者在38岁时就当选了美国科学院院士。
NMR样品的取得:浓度至少在1毫摩尔左右,体积约1毫升,且需要C13和N15标记的蛋白质。提取蛋白质的细菌培养液中必须含有C13的葡萄糖和N14的氯化氨。
光谱的取得:由于蛋白质光谱相当复杂,为了增加解析度和灵敏度,光谱必须在高磁场中取得,一般至少要500MHZ以上,现在最高为900MHZ选择性测定特定作用:在核自旋系统中,多重作用同时存在,使得光谱过度复杂。在单一实验时必须抑制其它大部分的作用,而选择性观察其中一种作用。间接测定灵敏度底的核自旋:C13和N15的灵敏度仅为H1的1。6%和0。1%。为了测得这些低灵敏度的核自旋,一般利用J偶合技术将其磁性转移到H1做间接测定,以提高灵敏度。多维核磁共振光谱:即使是一个分子量为1万的小蛋白质,其H1数目都在500以上,一般一维共振光谱线重叠会非常严重,无法分辨,必须在二维及多维光谱上才能有足够的解析度加以分辩所有光谱线和进一步标定所有光谱线。水光谱线的抑制:溶液中水的H1浓度为110M,而蛋白质样品的浓度为1MM,两者之间差万倍。如果不抑制水的信息,则无法探测到蛋白质的信息。
核磁共振光谱可以获得以下结构的限制:距离:两核之间的距离,可以由NOESY谱取得。理论上交叉峰的强度和距离之间的关系可用数学公式表示,然而蛋白质上的原子并非固定不动,因此难以量化,一般将它们区分为强,中,弱和很弱四种。这样的限制在结构计算上虽然稍显宽松,但数百甚至上千的这些稍宽的限制同时存在时,弥补了宽松的缺点。二面角:蛋白质骨架 面间的夹角可以由COSY求得。氢键:蛋白结构中的二级结构螺旋和折叠可利用NMR光谱线的化学位移指数测得。
残存磁偶矩
结构的计算:以正确的键长建构待决定结构蛋白质的起始结构,再加上NMR取得的结构限制,利用度量矩阵距离几何学和分子动力学以及模拟淬灭方法,计算出最符合结构限制且能量最低的结构。通常利用一组的结构限制可以利用不同的起始结构重复计算60到100个结构,选取其中不违背结构限制且能量最低的20个结构加以进一步的分析,计算出平均结构,加以能量最小化,作为代表结构。NMR测得的结构最大特点是部分重叠得很好,部分则很松散,松散部分通常为较具动态的部分。
结构的分析:
可以得到蛋白质的电性分布,可以作为合理药物设计的蓝图。
蛋白质的动态结构:蛋白质在生理条件下,内部的一些部分处于动态状态。这些动态对蛋白质的功能影响很大,且是目前研究的热点之一。核磁共振光谱是探讨蛋白质动态结构的最佳方法。蛋白质核磁共振正在经历静悄悄的的复兴时期。NMR 研究稀释样品的能力得到显着提高。在使用简单的一维NMR实验来解决生物学问题,如信号通过G蛋白偶联受体,出现了回潮。使用监测蛋白质 - 配体与蛋白质 - 蛋白质相互作用的NMR进行了扩展。NMR顺磁弛豫增强(PRE)技术扩展了NMR作为探针研究蛋白的结构与动态的功能。甲基TROSY NMR允许NMR探测 > 200 kDa的蛋白质复合物的结构和机制问题。核磁共振技术在药物发现中增加使用。NMR,现在可以用来探测活细胞中的蛋白质结构与相互作用。无细胞表达方法拓展的NMR的适用性和效率。放松分散方法为隐秘的结构和动力学状态提供了前所未有的机会。NMR 提供了洞察本质无序蛋白质和多域蛋白质崭新的方法。NMR是研究蛋白质结构,折叠,动态,互动,和功能的强有力的工具。
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