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注:直接和脂类或核苷酸结合的荧光分子、连有荧光分子的Aptamer或是连有荧光分子的FISH实验用探针,都可以代替抗体作为特异性识别的载体。
从单个分子的定位精度而言,一般(d)STORM的荧光分子产生的光子数都是PALM中的10倍以上,这会大大提高定位精度。从标记密度而言,在PALM中,一个目标蛋白只带有一个荧光蛋白,这个荧光分子一般只有一次到有限几次机会被定位;而(d)STORM中,每个蛋白质可能被多个一抗标记,每个一抗又可能被多个二抗识别,每个二抗分子一般带有几个荧光分子,每个的荧光分子,一般都可以被定位十数次以上。在活细胞实验中,如果要追踪某个分子,这种多次定位是有益的;然后对于固定细胞实验,对同一个分子过多的定位次数并不值得追求(后面会提到,它降低了事实上的明-暗周期的值,以及标记密度)我们都是从荧光分子的定位来推断生物目标的位置,二者不能相聚太远,这就使得标记大小也成为值得考虑的因素。PALM实验中的光控荧光蛋白一般只有几个纳米的直径,而使用一抗和二抗的(d)STORM,加起来则有20nm以上。将荧光分子连在小分子上(例如Phalloidin),或是单链抗体(Fab’),可以减小这种影响。不过一般来说,这个因素不是最重要的。
遗传标记和dSTORM还可以结合起来,取长补短。例如在目标蛋白的序列中,加入很短的蛋白质序列,使其可以被FLAsH tag识别。加入的蛋白序列只有几个氨基酸长,对蛋白功能影响比普通的荧光蛋白(几百个氨基酸)小的多。FLAsH tag本身可以携带优质的荧光基团,实现(d)STORM精度的定位。这种方法特别适合活细胞的成像。类似的,Halo Tag、SNAP Tag或TMP tag也已经被作为遗传标记的载体用于dSTORM实验中。
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GMT+8, 2024-11-7 18:29
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