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荧光标记的选择和组合

已有 5249 次阅读 2013-6-14 10:32 |个人分类:评论|系统分类:科研笔记| 荧光

(d)STORMPALM的选择,与细胞学实验中选择免疫荧光染色或是遗传学标记的很多考虑是一样的。(d)STORM可以用抗体识别内源性的蛋白,但识别的特异性受到抗体质量的影响(例如对于有些蛋白质,并没有特异性高的抗体)。而PALM需要对目标蛋白基因进行序列修饰,加入光控蛋白的片段,再转染目标细胞。在目标蛋白上连接一个新的蛋白,不可避免会对其功能、细胞定位或与其它分子的相互作用产生影响;而转染很多时候是在强promoter的控制下产生过量的蛋白,也会产生很多非生理性的变化,并且不能排除内源性的蛋白的作用。当然,如果要研究某种特异性的序列变异,就只能使用PALM

注:直接和脂类或核苷酸结合的荧光分子、连有荧光分子的Aptamer或是连有荧光分子的FISH实验用探针,都可以代替抗体作为特异性识别的载体。

   从单个分子的定位精度而言,一般(d)STORM的荧光分子产生的光子数都是PALM中的10倍以上,这会大大提高定位精度。从标记密度而言,在PALM中,一个目标蛋白只带有一个荧光蛋白,这个荧光分子一般只有一次到有限几次机会被定位;而(d)STORM中,每个蛋白质可能被多个一抗标记,每个一抗又可能被多个二抗识别,每个二抗分子一般带有几个荧光分子,每个的荧光分子,一般都可以被定位十数次以上。在活细胞实验中,如果要追踪某个分子,这种多次定位是有益的;然后对于固定细胞实验,对同一个分子过多的定位次数并不值得追求(后面会提到,它降低了事实上的-暗周期的值,以及标记密度)我们都是从荧光分子的定位来推断生物目标的位置,二者不能相聚太远,这就使得标记大小也成为值得考虑的因素。PALM实验中的光控荧光蛋白一般只有几个纳米的直径,而使用一抗和二抗的(d)STORM,加起来则有20nm以上。将荧光分子连在小分子上(例如Phalloidin),或是单链抗体(Fab),可以减小这种影响。不过一般来说,这个因素不是最重要的。

遗传标记和dSTORM还可以结合起来,取长补短。例如在目标蛋白的序列中,加入很短的蛋白质序列,使其可以被FLAsH tag识别。加入的蛋白序列只有几个氨基酸长,对蛋白功能影响比普通的荧光蛋白(几百个氨基酸)小的多。FLAsH tag本身可以携带优质的荧光基团,实现(d)STORM精度的定位。这种方法特别适合活细胞的成像。类似的,Halo TagSNAP TagTMP tag也已经被作为遗传标记的载体用于dSTORM实验中。




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