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   用加热的方式控制外源基因表达和离子通道开关，在生物医学中有着非常广泛的应用。热激蛋白启动子是一组在结构上高度保守的多肽，当外部温度较高（大于35度）时，该启动子被激活并调控其下流基因的表达。该方法是发育生物学中一个非常重要的实验手段。在离子通道大家族中，最近有许多对温度敏感的离子通道被发现，但对它们的生物学功能的研究还相当匮乏。通过局部加热的方式控制离子通道的开关是研究其功能最有效、直接的实验方法。

传统的加热的方式主要用水浴（37度水浴箱）或者电子元件（电阻）对活体生物或者活体组织、细胞进行加热。传统方式有以下四个缺点：

（1）无法微区域加热。无论是用水浴还是电加热，只能对生物标本整体或者大面积局部加热，无法对感兴趣的微区域（十到几十微米）或者单细胞（十微米）进行精确定点加热；

（2）加热效率低。用水浴激活热激蛋，通常需要对生物标本或者组织持续加热1到2小时。长时间加热对生物个体有较大的损伤，影响其生物活性；

（3）无法精确控制温度。不同组织对热的传导性不一样，导热模型复杂，理论上很难计算加热区域的实际温度梯度分布。同时，传统方法无法实时监控不同区域的温度并进行相应调控；

（4）无法深度加热。由于生物组织不良导热性，使得部分内部组织无法得到有效的加热。

1、 技术方案。

利用高功率低噪音的远红外激光（1450 nm至 1500nm）加热生物标本，使得被加热的微区域在几微妙内温度就能迅速升高十几度到几十度。

本发明的有以下两个主要理论依据：

（1） 生物组织里面的水分对远红外波长吸收效率高，而蛋白质和脂类对远红外波长的吸收效率低。生物组织主要由水、蛋白质、脂类和核酸组成，其中水分占到了80%以上。在1450nm-1500nm附近，水的吸收系数远高于水对可见光（400-700nm）的吸收系数，高达 10000倍以上。而其它成分，如蛋白质和脂类，对远红外的吸收很低。用1450nm对生物组织进行加热，能有效快速加热组织中的水分， 进而间接加热但是不损坏其余重要成分，保持生物活性。

（2） 显微镜物镜对激光的精确汇聚能力。市场上通用的显微镜物镜对激光有非常好的汇聚作用，焦点处光斑大小在1微米左右。

本发明克服了传统加热方式的缺陷，有以下三个优点：

（1） 微区域加热。通过明场或荧光显微镜找到感兴趣的单细胞、细胞群或小面积组织，然后用激光进行精确的定点加热。根据不同的实验需求，可以一次加热几个微米的区域（单细胞水平）或者几十微米的组织；

（2） 快速加热。在远红外激光的刺激下，组织温度在几微妙内就能升高十几度，并稳定在平台期。根据本公司的初期实验结果，1秒就可以激活斑马鱼中的热激蛋白启动子，远优于传统水浴方法的几十分钟；

（3） 实时监控温度。在对生物标本就是远红外激光加热同时可以进行荧光成像。一些荧光团的荧光强度和温度成线性关系，通过测量荧光强度的变化实时监控微环境的温度。

（4） 深部加热。由于远红外激光对生物组织（脂肪类等）有较高的穿透性，可以无创伤加热深部组织。

2、 具体实施方式：

在普通荧光显微镜上安装远红外激光器以及相关光学和电子配件，通过红外激光加热标本，用光学快门控制加热时间，通过自动平台移动加热位置。利用系统中的平凹透镜和平凸透镜组合调节红外激光的分散度，矫正系统中的光学色差。整套系统可安装在不同品牌公司的倒置和正置显微镜镜体上。图1和2分别是安装在倒置显微镜的结构正面图和侧面图；图3和4分别是安装在正置显微镜的结构正面图和侧面图。两种结构安装方式相似，八个核心部件相同，每个部件在图1到图4中的编号相同。在图1中，远红外激光线路用红色线表示，荧光线路用黑色线表示，远红外激光和荧光的混合线路用蓝色线表示。下面用图一来说明每个配件的规格型号以及它们之间连接方式。

（1） 远红外激光器、耦合器、光纤和准直器（图1A和图5）。激光器采用高功率低功耗远红外半导体激光器，波长为1450nm或者1470nm，输出功率大于150mw。激光器的输出口连接到耦合器，通过调节耦合器内部的非球面镜，把激光光束耦合到内径为100-200微米光纤（1300-1600nm）的输入端。光纤的输出端链接准直器，调节准直器内部的非球面透镜位置，使输出激光为平行光（高斯光束）。准直器的输出激光光束功率不低于100mw。激光器、耦合器、光纤和准直器的结构位置关系见图5。该组和部件可选用长春新产业光电技术有限公司生产的1450nm红外半导体激光器（型号：MDL-1450(FC)或者 FC-1450）或1470nm光纤耦合激光系统（型号：MDL-1470(FC)或者 FC-1470或FC-W-1470）。

（2） 电子光学快门、快门控制器以及控制软件（图1B）。准直器和光学快门通过自制适配器连接。光学快门的光圈大于15毫米，快关的响应时间低于10微妙。控制器为光学快关提供驱动电源，控制光学快门开关。控制器配备TTL输入接口，高TTL打开光学开门，低TTL关闭光学快门。TTL的电压高低由定制软件控制。电子光学快门和控制器可选用Vincent Associates公司生产的VCM-D1单通道控制器和LS6光学快门。

（3） 透镜组合（图1C1和C2）。透镜组合由抗反射增透膜的平凹透镜和平凸透镜组成，由定制的透镜套管固定。平凹透镜的焦距（-f1）在75毫米到125毫米之间，平凸的焦距（f2）在125毫米到175毫米之间，两个透镜的初始距离（D）满足D=f2-f1。小范围调节D（小于5毫米），改变红外激光辐射发散角矫正系统中的色差，使得远红外激光和可见光在物镜后（图1F）能聚焦在同一个平面。平凹透镜和平凸透镜可选用Throlabs公司生产的N-BK7（1050-1620nm）系列球面透镜。

（4） 金属卤素灯（图1D）。选用市场上通用的金属卤素灯，提供荧光成像的激发光光源，如Lumen Dynamics Group公司生产的X-Cite® 120系列荧光灯。

（5） 远红外-可见光双色镜（图1F）。双色镜固定在标准显微镜滤光立方体内，安置于显微镜荧光转盘中。该双色镜对45度角入射的1450和1470nm的激光反射率大于90%；对45度角入射的可见光（400-700nm）透射率大于80%。双色镜可选用Semrock公司生产的45度角低通双色镜（FF746-SDi01）；显微镜滤光立方体可选用Throlabs公司生产的MDFM-MF2。

（6） 荧光滤光片组合（图1E1、E2和E3）。该组合包括一个直径25毫米的发射滤光片（E1）、直径25毫米的激发滤光片（E2）和与之配套的二向色镜（E3）。该组和固定在标准显微镜滤光立方体内，安置于另一显微镜荧光转盘中。在倒置显微镜中，该组合处于远红外-可见光双色镜的垂直正下方（图1和2）；在正置显微镜中，该组合处于远红外-可见光双色镜的垂直正上方（图3和4）。荧光滤光片组合可选用市场上通用的滤光片组合。

（7） 显微镜物镜（图1F）。显微镜物镜固定于显微镜物镜转盘中。物镜需选择干系物镜，放大倍数介于40x到63x之间，数字孔径大于0.6，对远红外光的通透率大于50%。物镜可选用Olympus公司生产的40x物镜（型号：UPlanFL，∞/0.17 )。

（8） 显微镜自动平台（图1G）。自动平台需安装显微镜镜体上，并提供可编程控制的RS232接口或其它标准接口。通过定制的程序，控制自动平台移动到指定位置。自动平台的移动误差小于0.1微米，移动速度大于1毫米每秒。自动平台在移动过程中，电子光学快门处于关闭状态。自动平台可选用Applied Scientific Instrumentation公司生产的MS-2000三维移动平台。

除了以上的八个核心配件，该发明还配备矫正载玻片。在显微镜载玻片（厚度1mm）的表面平放热敏纸，施加一定压力后用盖玻片（厚度0.17mm）覆盖、封片做成矫正载波片。热敏纸可以记录红外激光通过物镜的激光斑点大小和相对位置，为加热标本提供位置坐标。

图2：安装在倒置显微镜镜体上的远红外温度跃升显微镜结构侧面图。各配件和图1相同。