基因手术刀—CRISPR-Cas9技术

生命的奥秘是如此令人着迷，而居于生命体系核心地位的基因又在其中起着关键的作用。最初人们认为，只要把所有的基因序列的信息知道就能够知道它们的功能，了解生命的奥秘。但是随着人类基因计划成功测定了人类30亿个碱基，人们却更加迷惑了。最初科学家预测人类基因组至少含有10万个编码蛋白的基因，结果发现人类基因组中编码蛋白的基因不到3万个。那么这么少的基因为什么构成了人体如此复杂的体系呢？

要想研究基因的功能，就需要能够对基因进行有效的操控。但是基因是如此的微小，不像汽车零件一样，随便拆卸。这些困难并未能阻挡聪明的科学家创造出对基因进行修饰的方法：meganucleases, zinc finger(ZF) nucleaseses, transcriptionactivator-like effectors(TALEs)。生物领域的人对这些应该都有所了解。但是这几种基因操控的技术，都有明显的缺陷，例如应用最广的TALEs技术，构建它的重复序列是件费时费事的事情，并且还有明显的context-dependentspecificity。

科学领域最不缺少的便是创新。在这样的背景之下，CRISPR-Cas9技术横空出世，CRISPR-Csa9技术就像一把精确的手术刀可以对基因进行精确的切割。2013年，science杂志上同一期发表了两个实验室独立的有关CRISPR-Cas9技术的研究结果[1][2]，这两篇文章仅仅过了一年多就分别被引用七百多次。做出这项成就的两个研究组一个是成名已久的由成名已久的大牛George M. Church(美国科学院和工程院双院院士)领导的，另一个却是冉冉升起的科学新星 Feng Zhang领导的。在这里想多提一下Feng Zhang，Feng Zhang于2004年在哈佛拿到学士学位然后于2009年拿到斯坦福博士学位，现在是MIT的assistant professor。尽管Feng Zhang出道不久，但是已经做出了很多学者一辈子都做不出的成就：optogenetics技术和CRISPR-Cas9技术。前一项optogenetics技术搞神经的人应该非常了解，光遗传学已经被广泛运用到神经生物学领域，现在逐渐被运用到分子生物学方向。后一项CRISPR-Cas9技术，现在已成星火燎原之势被生命科学领域广泛应用。

CRISPR全称为clustered regularly interspacedshort palindrome repeats,最初是在大肠杆菌中发现的一类特殊重复序列，之所以特殊是因为不像通常串联起来的重复，而是被非重复的序列间隔起来的重复序列。Cas就是CRISPR-associated genes，被发现是一类内切酶。经过二十多年的基础研究发现CRISPR-Cas系统是一种在细菌或真菌内广泛存在的免疫防御体系。其基本原理是通过CRISPR中能够与侵入细胞中的DNA进行配对，然后指导Cas内切酶对与guideRNA进行配对的DNA进行切割，从而来保护细菌。

2013年science上面的两篇文章创造性的把存在于细菌或真菌系统中的CRISPR-Cas系统进行改造，使之在哺乳动物细胞内能够特异的切割与guide RNA配对的基因。只需要把guide RNA与Cas9内切酶转入细胞内就能够对特定的核苷酸序列进行切割从而敲除特定基因。由于在这种系统中，cas内切酶是由RNA指导切割的，相对于前面的几种技术要简单方便很多，适用范围也更加广泛。这种技术目前已被广泛的用于细胞基因的敲除及动物模型基因敲除。

一年之后，由Feng Zhang领导的实验小组与另外一个大牛EricS. Lander（美国科学院院士，文章引用率在整个生命科学领域最靠前的几位之一）的实验室在同一期science杂志上的发表了基于CRISPR-Cas9的在哺乳动物细胞中大规模筛选的系统[3][4]。在这里值得一提的是北京大学生命科学学院的魏文胜实验小组也随后不久在nature杂志发表类似的文章。

我们知道基于获得诺贝尔奖RNA干扰技术的siRNA及shRNA技术在大规模筛选一些致病基因方面，大显身手，很多CNS文章都是用这种方法做出来的。但是基因RNAi的siRNA及shRNA先天就有缺陷，它们是基于通过干扰转录出的RNA来对基因表达进行调控，只能够部分降低基因的表达，另外它们的非特异敲减也很严重。而基于CRISPR-Cas9技术的大规模筛选系统，直接对基因进行修饰，能有效的敲除细胞内的特定基因，另外目前来看其非特异性敲除相对较低，尽管在这一点上还存在争议。

期待不久的将来可以看到更多基于CRISPR-Cas9技术的精彩文献，希望大家能够能充分利用CRISPR-Cas9这把锋利的基因手术刀，做出优秀的成果。

[1]Cong, L., Ran, F.A., Cox, D., Lin, S.,Barretto, R., Habib, N., Hsu, P.D., Wu, X.,

Jiang, W., Marraffini, L.A., and Zhang, F. (2013). Multiplex genomeengineering

using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819–823.

[2] Mali,P., Yang, L., Esvelt, K.M., Aach, J., Guell, M., DiCarlo, J.E., Norville, J.E.,

and Church, G.M. (2013a). RNA-guided human genome engineering via Cas9.

Science 339, 823–826.

[3] Shalem, O., Sanjana, N.E.,Hartenian, E., Shi, X., Scott, D.A., Mikkelsen, T.S.,

Heckl, D.,Ebert, B.L., Root, D.E., Doench, J.G., and Zhang, F. (2014).

Genome-scaleCRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science

343, 84–87.

[4] Wang, H., Yang, H., Shivalila, C.S., Dawlaty, M.M.,Cheng, A.W., Zhang, F.,

and Jaenisch, R. (2013). One-step generation of micecarrying mutations in

multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.Cell 153,

910–918.