最近一年时间里收到很多同学和朋友关于454数据处理的询问，通过QQ，微信，人人网和邮件等各种途径，当然不少也是面对面的讨论。这些同学和朋友包括同组的，跨组的，同所的，跨所的，其他大学的，来自北京的、南京的、广州的、西安的，甚至也有国外的中国朋友。有些朋友我素未谋面，也不知长相如何，不知男女。有时候同一天能收到五六份邮件，问题之五花八门，有时已经超越了我所能够解答的范围。

这些现象也反映了当前生物信息学的急剧变革，第二代测序技术就像Iphone问世一些，彻底席卷和重新定义了当前生态学研究的方法和手段。而几年前费用昂贵的第二代测序如今已“旧时王谢堂前燕，飞入寻常百姓家”，于是乎大潮裹挟之下的硕士生博士生们都想出来耍耍，扔个十几万块钱，希望能够轻松的收获几篇文章。

科研论文的发表讲究“猎奇性”，大家都喜欢看到新奇的方法和漂亮的图表。但我认为这其实也是当今科研界的弊端之一，讲究创新和手段的先进，而忽视了研究的重要性。以微生物生态学的旗舰杂志ISMEJ为例，最近一年多发表的学术论文里，第二代测序技术已经是寻常方法，所谓第三代的单细胞测序技术也开始出现。研究生物信息学的来自美国科罗拉多的Rob Knight能够作为ISMEJ的高级主编，方法对于微生物生态学研究的重要性可见一斑。

前几天读到阿伯丁大学的James Prosser教授在Nature上发表的一篇观点文章“Think before you sequence“，在这里面他讲到，第二代测序只不过是一个工具而已，我们的研究依旧要从扎扎实实的假设出发，设计实验来解决问题和验证假设。高通量测序并不能弥补实验设计的缺陷。我在阅读文章的过程中也发现，设计合理和完整的实验，即使使用传统的Sanger测序技术，依旧能够说明和解决问题，并能够发表到高档次期刊上。而如果使用第二代测序技术，但是数据处理有问题，数据质量控制不好，文章也很难得到发表，相当于花钱买罪受。

我从2011年秋天开始学习454数据的处理，在学习的起始阶段，能够和师弟袁超磊一起探讨和交流，并且几乎阅读了ISMEJ上所有与第二代测序技术有关的文章，所以能够很快的上手。在此我也对师弟袁超磊表示正式的感谢，祝愿他在阿德雷德大学能吃上可口的饭菜。

很多朋友的问题我未能一一解答，在此也表示歉意。我经历过学习454数据处理的漫长和痛苦的过程，我很清楚有时候一句话或者一段话很难解决所问的问题。去年我自己投出的文章经历了很多次的拒稿，十几位审稿人和生物信息学家对数据处理提出了建议，现在经过在悉尼和生物信息学专家的讨论，我也能够更加合理地看待数据处理的问题。摸着石头过河的一些经验和建议，在这里进行分享，希望正在摸索和思考中的你，觉得并不孤单。

1. Mothur和QIIME那个软件更好？
 

Mothur是美国密歇根大学的Patrick Schloss在2009年开发的数据处理平台，它的前身是Dothur软件，相信大家都听说过。这两个软件的发音分别为Mother和Daughter，是Dr Parick献给他的妻子和女儿的。另一个被广泛使用的数据处理平台是QIIME,也是美国科罗拉多Rob Knight等人于2009年开发出来的。截至今天，Mothur的方法文献已经被引用1229次，而QIIME被引用574次。这说明Mothur比QIIME有更广泛的群众基础。

我刚开始学习使用的就是Mothur,我个人非常喜欢这个开源的数据处理平台，基本能够实现我的所有数据处理目的。Mothur软件无需安装，在Windos, Linix,和MacOS系统上都可以运行。我研究了Mothur每一个中间导出文件的格式和原理，所以我能够将这些中间产生的文件导入其他软件进行处理和做图，比如R语言。很多人不喜欢Mothur，都是因为Mothur不能够直接出图，必须依赖于其他软件。而这正式我所喜欢的原因，我现在也正在进一步学习R语言，R的做图功能是非常强大的，其实大家平时看到文章上那些非常漂亮的图，大都是R语言做出来的。所以，如果将Mothur和R结合，我认为是一个能正确处理数据并完美展现数据的途径。除了罗氏454数据处理之外，Mothur现在也有了针对Illumina数据的处理方式，大家从Mothur的网页上就可以读到Dr. Patick写的标准数据处理流程。

现在QIIME携苹果电脑的时髦，也得到了很多人的青睐。这个软件我本人没有真正使用过，但是知道QIIME只能在MacOS和Linix系统上运行，当然也可以通过在Windos系统上安装Virtual Box来运行。这个软件出图的效果比较好，很多人把直接出的图用来发表文章。我所在的悉尼这边的研究所的生物信息学专家也是用QIIME来处理数据。我就这个软件问题和他讨论了好多次。基本来说，两个软件都可以帮助我们实现正确的数据处理，并不存在哪个更好的问题，只有个人在使用上的喜好。

我希望你无论使用那个软件，都仔仔细细阅读软件网页上的教程，并熟悉所有的命令。自己一一试试各个命令，合理组合命令，这样才会通过修改命令来正确处理自己的数据。这个过程没人可以帮你，只有你自己能够救赎自己。

2. 数据处理难学吗?

这是一个我一直以来很想告诉所有人的问题。说实话，那两个软件都很好使用，有标准的处理流程在那里等着你，把所有数据处理下来绝对不超过十天时间。但是，为什么我们几个月甚至一年都拿不下来数据处理？

因为数据处理的难点不在于软件的使用，而在于你对微生物生态学基本概念的了解。我认为我们需要在数据处理之前就应该特别清楚的是1）α多样性的各种指标。数据条数的多少会直接影响α多样性的计算结果，它们之间是正相关关系。所以计算α多样性必须统一序列条数。而我们知道统一序列条数就会舍弃很多条数不足的样品，这个取舍就涉及到很多的经验问题，需要你阅读很多的文献来了解；2）β多样性的表征方式。我研究β多样性的时候，阅读了很多相关的文献，对Bray-Curtis指数，UniFrac等都非常了解。选择能够最好表现你多样性差异的指数，需要花很多很多的汗水。3）多元统计方法。这个又是更大的难点了，Mothur不会告诉你，QIIME也不会告诉你。你只有去阅读教材，阅读文章，才能弥补这些缺陷。不然你连那些命令都读不懂，还谈什么数据处理，修改命令。4）文章的构思。这又是更高一级的知识预储备了。在你的数据处理之前，请阅读所有高质量期刊上的相关文章，至少需要预估计，你可以出哪些图，做哪些分析。其实在数据处理的过程中已经是你不断验证假设和推翻假设的过程。

希望你在数据处理之前踏踏实实地做好这些功课，不然你很难完美运行各个命令。另外，要仔细研究各个软件的原理，做到人机合一的效果。因为有时候软件并不能解决所有问题，比如在alignment的时候，有时候在部分区域比对效果不好，你需要使用合适的软件打开这些中间文件，手动进行删除，不然会影响后续的多样性计算。所以，你需要把自己练成一台机器。2010年我做过同位素超高速离心，尽管已经有很多文献可供参考，我当时还是研究了离心机的原理和等密度梯度离心的原理，所以自己就很清楚应当如何优化实验条件，获得最好的数据。

3 细菌和古菌16S数据和功能基因数据处理的不同？

如果你处理的是细菌16S数据，那么恭喜你，你应该很容易完成数据处理，因为Mothur和QIIME都包含了细菌16S比对和分类的数据库。因为细菌的研究已经非常多，所以分类的效果也很好，未知的类别一般也很少。

如果是古菌16S的话，RDP，Greengenes，SILVA等数据库我都用过，分类效果都很差，但是不影响你的多样性分析。因为古菌的纯培养仍然很少，分类问题仍然是处于发展阶段。你基本也可以顺利按照标准流程完成数据处理。

但是功能基因的话，就面临很大很大的难题。如果想测序功能基因的同学，一定要三思而后行，我自己在这方面进行了很多的尝试，虽然知道处理的方式，但是解释起来真的很难。就像我在上面所说的，如果你不了解Mothur和QIIME的文件格式，基本架构，我很难告诉你怎么去实现自己的目的。所以大家也可以看到，现在发表的关于功能基因测序的文章很少很少。大家基本都是DIY，都是一些很熟悉生物信息学的国外实验室发表的。希望你能认识到功能基因处理的难点1)第一步是比对alignment，一开始就做不了。因为没有可供使用的alignment reference数据库。我的经验是自己做一些，从NCBI上下载功能基因序列，然后自己通过MUSCLE或者ARB比对的很齐，然后作为参比序列；2）分类。这个更难，需要经过alignment之后，分成不同的OTU，然后从每个OTU中选择一个代表序列，通过BLAST进行分类。3）分OTU。对于细菌和古菌16S而言，97%代表species水平，但是功能基因就完全不一样。以氨氧化微生物研究为例，AOA的species-level OTU应当是87%，而AOB应当是80%，所以和16S数据完全不同。

对于必须要做功能基因的同学，我建议可以考虑基因芯片（microarray）的方法。现在针对pmoA和amoA基因的基因芯片都已经开发的非常完善，国际合作也不是难题。Microarray通过设计的探针合理解决了分类的问题，价格比454测序也便宜，数据处理简单。所以我认为是一种更好的方式。