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发展细胞系：培养的艺术
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Alan Dove / 文 高大 姜天海 / 译
1951年2月8日，美国约翰霍普金斯大学George Gey通过宫颈癌活细胞检查分离出一些细胞，并将它们放在具有某种培养基的培养皿上。这株细胞（来源于名为Henrietta Lacks的患者）不同于Gey和同事所试验过的其他细胞，非常完美地适应了新环境。八个月后，Lacks死于癌症，但是她的细胞（被称为HeLa细胞）成为了首个无限增殖细胞系，具有在人工培养情况下无限增殖的能力。在完成分离后的几十年间，科学家们已经培养出大约20吨的HeLa细胞。
同时，研究人员已经找到众多的方式，能将来源于人类和动物的原初组织转化为无限增殖细胞系。如今，实验室供应商和非盈利性的存储库中拥有成百上千的细胞系，专门适用于完成从产生蛋白到病毒培养的任何工作。虽然胚胎干细胞和诱导性多功能干细胞可能得到更多的媒体关注，但是普通的体细胞系仍然形成了生物医学研究的支柱。
细胞系的选择已经扩展到了广泛的物种中。位于弗吉尼亚州马纳萨斯美国模式培养物研究所（ATCC）的细胞生物学组首席科学家和负责人Fang Tian说，“在（我们）常规种类中，我们实际上已经具有超过60个种类，并且有一些是来源于国外的。”ATCC目前保存有超过3000个细胞系。位于新泽西州卡姆登的卡瑞尔医学研究所也维护着几千种，他们重点关注的是代表特定疾病的人类株系。
比例的问题
即使成千上万的细胞系仅需要点点鼠标或打个电话就能获得，但科学家们还是觉得选择不够充分。这正是加州大学旧金山分校医学院博士后学者Mark Stenglein在研究蛇体中包涵体病（IBD）时所面临的情况。
该项目最初是因为一个毒蛇爱好者找到了Stenglein的导师Joseph DeRisi，DeRisi是霍华德休斯医学研究所（HHMI）的研究员，也是加州大学旧金山分校的生物化学与生物物理学教授。蛇爱好者解释道，包涵体病能够引发行为改变，然后使人消瘦、再次感染，直至死亡，这是宠物蛇贸易中的一个大问题。对于该病的起因，兽医也一无所知。出于好奇，DeRisi和Stenglein决定去看看病毒是否应该为此负责。
通过与蛇主和兽医合作，该团队进行了宏基因组测序并且找到了感染包涵体病的蛇体中存在沙粒病毒的证据。当Stenglein想要试着去培养这些新的病毒时，麻烦开始了。普通的对沙粒病毒友好的哺乳动物细胞系根本不起作用。“ATCC总共就有四种爬行类动物细胞系，因此我们全都订购了。”Stenglein说，但是在其中任何一种细胞系上，病毒都无法复制。
通过他们联系到的新兽医，Stenglein和DeRisi收集了来源于一条名为Juliet的大蟒蛇（死于淋巴瘤）的组织。Stenglein随后试验了多种分离方法来无限增殖Juliet的细胞。“这就有点像那种乘法问题，你要是开始改变条件，它就会迅速失去控制，” Stenglein说，他一次就在温箱中培养了50~100个平板的细胞。为了保持问题可控，他尽可能地将可变因素最小化。
例如，他只用了一种细胞培养基配方：最小必须培养基（minimal essential medium，MEM）——这是一种最初由Harry Eagle所发明的溶液，可以维持许多细胞的基本需求。最近，大量的其他培养基也得到研发，用来迎合有特殊需求的用户，包括敏感和难以培养的细胞以及来源于不同物种的细胞系。
Stenglein也在相同的温度下培养所有的平皿，仅仅改变细胞提取的方法。最终有效的方法是利用手术刀简单地将组织切成片，然后将它们浸入胰蛋白酶中进行过夜培养。最终这种方法产生了两种新的细胞系，一种来源于Juliet的肾脏，另一种来源于它的脾脏。
这些新的细胞系现在已经通过多种渠道传播出去。利用这些细胞系，研究人员研发出了检测新型沙粒病毒的方法，并将其使用在未患和已患包涵体病的蛇体中。由于该结果显示沙粒病毒感染与包涵体病有很强的相关性，说明该病毒可能引起了这种疾病。
Stenglein现在将研发新细胞系单纯视为他可以在未来使用的另一项实验室技术——尽管他还没有近期的研究计划。“我只会在某个研究项目有需要的时候去做。”他说道。然而，他强烈建议其他人去考虑构建新细胞系，特别是如果他们所研究的物种是大的保藏库中没有得到充分代表的物种。“这并没有你想象得那么难，如果你所处的情况是你的研究问题将会因拥有一个（新的）细胞系而获益，那么你值得去试试。”
对于那些研究爬行动物的人，DeRisi的实验室愿意将Juliet的细胞系分享给任何感兴趣进行研究或使用的人。他们的确想要将细胞系提供给保藏库，但是遭到了拒绝。
培养的宝库
的确，想要从“外源”物种中构建其他细胞系的研究人员可能也会从保藏库中得到相似的回应，首要原因是经费。“早先ATCC确实有政府的经费支持，因此我们愿意接受研究人员的任何请求，做了细胞银行、细胞鉴定来确保这种系是它应该有的样子，并将它们扩散和分送到世界各地。”Tian说。然而，保藏库的政府经费早在20年前就停止了，因此迫使ATCC变得更加挑剔。目前，该非盈利机构只能加入那些他们认为具有高需求和广泛科学兴趣的新细胞系。
Coriell研究所仍然具有充足的联邦经费支持，但是他们的关注点在于人类和非人的灵长类细胞系。该研究所维持了一个具有数千样品的宝库，范围涵盖了从脐带血到患罕见遗传疾病的患者临床分离样品。
除了存储现有的细胞系，在构建新细胞系方面，保藏库也处于领先。
构建新细胞系最简单的方式是去修饰一个现有的细胞系，这是当已知细胞系已经能够近乎满足各种需求时的常用策略。优化培养特定病毒或最大化重组蛋白产出的细胞经常来源于这种修饰。建立一个全新的细胞系有时需要更多外源的技术。传统的试凑法（cut-and-try methods）如Stenglein所使用的方法可能会有效，但是专业的细胞系研发者仍然在不断地寻找方式来加速整个过程。部分由于对如Gey的HeLas细胞系等的细胞系研究，研究人员现在知道无限增殖最快捷的一条途径是通过病毒感染。例如，来源于SV40的大T抗原，或者来源于人类乳头状瘤病毒的E6和E7原癌基因，可以快速地将原代细胞培养转换为无限增殖细胞系。
由于病毒原癌基因能有效地将细胞转化为肿瘤，它们趋向于改变细胞的特性。现有的原癌基因也有某种限制范围，它们并不能在所有的细胞型上起作用。这也正是为什么许多细胞培养专家现在在病毒原癌基因基础上或代替病毒原癌基因，使用一种人类端粒反转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）。hTERT技术最初研发于1999年，这种技术能够产生表现出原初培养特性，但繁殖起来却像无限增殖细胞系。
肿瘤样品已经获得无限复制的能力，但常常需要一点帮助才能实现无限增殖。 对于原淋巴细胞来说，最容易的方法经常要使用Epstein-Barr病毒来感染细胞，这样在自然转化细胞的同时保持了大部分的正常生理活性。
Tian建议那些认为自己需要新细胞系的研究者，先查阅文献和保藏库的数据库。相似的细胞系经常能够通过修饰来满足科学家的需求，比重新构建一个新系要更快更便捷。如果现存的细胞系没有一个比较接近，下一步就是决定无限增殖原初细胞的通用策略。“如果你想要建立一个肿瘤（细胞系），那么一个自然形成的细胞系就有很大的可能性，但是如果你想要得到非肿瘤性的正常细胞系，那么hTERT……和病毒感染就是最通用的手段。”Tian说。
无论有没有额外的原癌基因，一些公司为hTERT无限增殖细胞提供完整的试剂盒，如位于加拿大不列颠哥伦比亚里士满的应用生物材料公司。德国海德堡的BioCat GmbH公司也售卖建立好的细胞系和细胞无限增殖所需的试剂。此外，研究人员可以直接将他们的原初细胞寄给BioCat公司，并由公司来构建细胞系。
无论采用哪种构建新细胞系的特定技术，任何类型细胞培养的常见问题依然会出现，例如微生物污染。支原体尤其难以处理，因为它们常常在培养物中不经意长出，并且悄悄地毁灭整个实验。来自ATCC、Lonza和InvivoGen的检测试剂盒能够鉴定这种神秘的入侵者。能防止污染当然更好，培养箱制造商已经试着通过改进设计以防止污染，采用的特性包括如用易于清洁的台面，自动化去污染循环和整体的空气过滤。
为蝙蝠辩护
尽管巧妙的技术有时能加速研发过程，但是每个细胞系派生出的问题都是独特的，就像Eric Donaldson若干年前发现的那样。作为位于马里兰州巴尔的摩马里兰医学院微生物学和免疫学助理教授Matthew Frieman的博士后研究员，Donaldson当时正在寻找一种冠状病毒。冠状病毒家族中包括了导致传染性非典型肺炎（SARS）和中东呼吸综合征（MERS）的病毒，这种病毒在蝙蝠体内很常见。遗憾的是，这些病毒一直难以从它们的自然储藏库中分离出来。
Donaldson想到，一种来源于蝙蝠的新型细胞系可能会有帮助。他很快发现研究蝙蝠的生物学家比和Stenglein打交道的蛇类爱好者更保守。“研究蝙蝠的生态学家非常注重于保护蝙蝠，因此我用了很长时间才敲开他们的门。” Donaldson说， 他现在是位于马里兰州银泉市美国食品药品监督局的病毒审核员。他补充道，他不得不向蝙蝠生物学家证明，他的兴趣在于帮助这些动物而不是摧毁它们。
最终，Donaldson和Frieman与一家位于弗吉尼亚州安南达尔的蝙蝠保护项目“拯救露西运动”建立了联系。一旦蝙蝠被汽车击中或者遭遇不明伤害无法救助时，“拯救露西”的志愿者就联系Donaldson，他们随后开车到该机构中心，在这些动物死后立即收取它们的组织。
因为蝙蝠可能会携带危险的人类病原，包括狂犬病毒，研究人员需要在配备了安全柜和限制性开放的生物安全防护二级（BSL-2）以上的实验室来针对这些组织开展研究。Donaldson使用了细胞分选仪来分离每个组织中的细胞，然后将hTERT和一个称为BMI-1的小鼠原癌基因引入到细胞中，试着进行无限增殖。绝大多数的实验都失败了，包括来自代表了4个物种的10只蝙蝠的多种组织。
“但是当它成功时，我们惊叹，天哪，真的成功了。” Donaldson说。他解释说在其中一个实验，“我们在第一天接种了原代细胞，两到三天后培养瓶中就（满是细胞），我们最终在四次培育后得到了如此多的细胞，都不知道如何处置它们。”该团队最终从三种不同的蝙蝠中构建了三个细胞系，并且能够在这些新细胞系中培养全新的冠状病毒。
从三个物种中构建新的细胞系令人钦佩，然而蝙蝠是在进化上最多样的哺乳动物类群，流行病专家开始越来越怀疑它们可能是大量新兴病原体的携带者。这也是位于德国波恩的波恩大学医学中心病毒学研究所研究人员Isabella Eckerle试图建立更多的蝙蝠细胞系的原因。
起初，Eckerle遇到了与Donaldson同样的障碍：蝙蝠的组织难以获得。在研究这个问题的同时，她开始在猪的细胞中试验她的组织培养方法，建立了将多种原初组织转化为无限增殖细胞系的操作步骤。她也创造了一种在野外快速冷冻细胞的技术。“这是我真正乐于去做的事情，因此我们无需外出并且牺牲蝙蝠，但我们还能与目前已经进行的项目相衔接。” Eckerle说。
当她最终获得一些蝙蝠组织时，Eckerle和她的同事们从两个蝙蝠物种的呼吸道上皮细胞中构建了新的细胞系，这两种蝙蝠代表了两个主要的蝙蝠亚目：Yangochiroptera和Yinpterochiroptera。“蝙蝠可能是最重要的空气传播病毒家族的主要宿主，如副粘病毒、冠状病毒或者是最近在蝙蝠中发现的流感病毒。”Eckerle说。通过仔细解剖微小的气管并建立原初培养，她使用SV40 T抗原来实现无限增殖。她和她的同事目前正在从其他蝙蝠组织以及其他种中构建额外的细胞系。
正如该领域的其他人一样，Eckerle也同意建立新细胞系很容易使人有挫败感，但是她认为回报是值得的：“因为这些模型十分新颖，你可以用它们来做许多事情。”■
（译者之一高大海系中国科学院海洋研究所助理研究员）
（Alan Dove 是马萨诸塞州的科学作家及编辑。
鸣谢：“原文由美国科学促进会（www.aaas.org）发布在2014 年11 月21 日《科学》杂志”。官方英文版请见http://www.sciencemag.org/site/products/lst_20141121.xhtml。）
鸣谢：“原文由美国科学促进会（www.aaas.org）发布在2014 年11 月21 日《科学》杂志”。官方英文版请见http://www.sciencemag.org/site/products/lst_20141121.xhtml。）
《科学新闻》 (科学新闻2015年4月刊 科学·生命)
https://blog.sciencenet.cn/blog-85876-885981.html
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