博文
数字PCR革命
|
Jeffrey M. Perkel / 文 高大海 姜天海 / 译
美国约翰·霍普金斯大学Ludwig中心联合主任Kenneth Kinzler与同事Bert Vogelstein一起首先提出了“数字PCR”的概念，二人表示研发这一方法是为了更好地鉴定稀有的癌突变。“你能得到的最灵敏的（检测）是来源于对单分子的观测，我们的点子正是来源于此。”Kinzler解释说，“当你从单分子开始时，（反应）要么是100%的突变，要么是100%的野生型，这使得从野生型中区分出肿瘤变得更加容易。”
当然，仅仅使用标准PCR也能找到非常稀有的变异事件。毕竟PCR擅长从分子的大海中捞针。理论上，在正确的引物和循环条件下，PCR反应能够将一个分子的模板DNA复制成数百万的子代双螺旋，足以克隆、测序或者进行凝胶电泳检测。但这一过程不是定量的，研究者无法用最终反应中的分子数目来推断起始样品中的DNA含量。
实时定量PCR通过在运行中量化反应解决了这一问题。例如，通过绘制随时间变化的荧光强度曲线，研究人员能够比较不同样品间给定基因的相对表达量。然而实时定量PCR的绝对定量并不够直接。它一般需要标准曲线来将含量转化为绝对的浓度，而且这些浓度经常会每天或在各实验室间产生变化。实时定量PCR也难以检测那些微小的拷贝数目变化，例如区分6个和7个拷贝，它的灵敏度有限。
美国密歇根大学副教授、Fred Hutchinson癌症研究中心（FHCRC）前成员Muneesh Tewari说，这种不确定性结果会比较复杂，就如数据分享，因为在建立多机构实验时，这是一大关键限制。他利用数字PCR进行小RNA生物标记的开发。“实时PCR不能保持每日的精确性，有时甚至难以确保一天之内的精确性。”他说。
数字PCR通过“逐个击破”的策略绕开了这一问题。分子混合物被离散或分隔化到大量的反应室中（越多越好），这样每个室中平均有一个或零个目标核苷酸。对每个区划进行PCR反应后，使用泊松统计将阳性信号的计数转换为一个绝对值。
Kinzler将这一过程比作桑格测序。在单个管中对100个模板分子的混合物（其中有一个是突变的）进行测序会产生一个电泳图谱，其中在突变位点上的显著信号会是野生型碱基。“你甚至基本不会发现，在（信号峰）下存在着一个表示不同碱基读取的小突起，因为它在整个分子混合物中的占比太低了。”但将这些分子稀释并将其分布在多重反应中，就能产生出99个野生型信号和一个明显的突变信号，这就是数字的、绝对定量的结果。
数字PCR本质上是把弱信号从噪音信号中“拎”出来，研究人员目前已在各方面采用这一策略，从检查拷贝数目变化和散布肿瘤DNA，到艾滋病毒载量检测和胎儿染色体异常检测。尤其是临床应用，将最有可能从这一技术中获益（假设这种技术的简易程度适合临床实验室的工作流程）。
原始的数字PCR
Kinzler和Vogelstein的原始“数字PCR”方法发表于1999年，是一项单调乏味，需要手工操作的办法。他们想要检测和量化直肠癌患者粪便样品中的K-RAS突变，因此将基因组DNA稀释并等分至384孔微量滴定板的各个孔中，这样整个板就代表了单个样品。他们随后扩增了包含所寻找的突变热点的基因区域。
一旦反应完成，（数字PCR基本上是个终端PCR分析，虽然不必如此），他们将两种荧光探针进行杂交，一种作为对照应该一直杂交，第二种是仅能与野生型序列结合，并读取结果。仅有超过100个孔具有基因组DNA，其中有四个显示出突变。
Kinzler说，这一结果表明数字PCR是“一种非常强大、可信和准确的”稀有突变检测方法。但它也是劳动密集型的技术，难以扩大。“说服一个研究生去做这个实验往往是不可能的。”他说。
2003年，Kinzler和Vogelstein设计了一个称之为“BEAMing”进阶版步骤，它依赖于“珠子、乳化、扩增和磁力吸附”。BEAMing替代了手工在微孔板中进行样品离散，将每个油包水乳化的小滴变成了反应容器。通过使用目前广泛用于下一代DNA测序文库制备中的乳化PCR过程，BEAMing将模板、引物、PCR试剂和磁珠的混合物分至小滴中，其中大多数的小滴不含有或只含有一个模板。PCR完成后，其中扩增产物会通过生物素——链酶亲和素的键合关联在磁珠上，乳化物随之会被打散，珠子就能通过与检测寡核苷酸和流式细胞仪的杂交物所读取。
BEAMing取代了在孔板上的手工操作，“能够处理相当于十万个孔”，Kinzler说，他仍然在使用这一技术，并（与Vogelstein和其他同事一起）成立了Inostics公司对其进行商业化。（Inostics随后被Sysmex公司收购，现在Kinzler并不持有该公司的股份。）
基于液滴的策略也被Bio-Rad实验室和RainDance科技公司进行了商业化。不同于磁珠，这两家公司都将PCR混合物离散（又或是如RainDance的董事长和首席执行官S. Roopom Banerjee所说的“液滴化”）成了2万个纳升大小（Bio-Rad公司的QX200）或者1千万个皮升大小的（RainDance公司的RainDrop）液滴。PCR扩增结束后，反应结果就可以通过荧光散射源和检测器来读取液滴，就像除去细胞之外的流式细胞仪。
Banerjee说：“将它想象成一台数码相机”。他说RainDance公司的RainDrop系统是一键式的设计，“Apple式的简单。你有一张具有多色彩和多层次的复杂相片。我们所做的基本就是将相片像素化成最小尺寸的像素，然后真的读出每个像素以准确说出那张生物相片中的内容。”在RainDance公司的案例中，需要用到4个小时来读取8千万个这样的“像素”，即8个平行数字PCR反应的输出量。
超强的泊松统计
由于dPCR是一种终端分析法，如果目标分子没有很好的离散化，如一些小室在结束时具有不止一个的靶标，那么理论上结果得到的浓度可能就会弃之不用。这就是泊松统计发挥作用的地方。据Bio-Rad实验室数字生物学中心科学事务部主任George Karlin-Neumann称，泊松统计描述了一种随机分布。只要小室没有达到饱和，用户就可以反算他们起始的分子数，即使一些孔中实际上容纳了不止一个分子（这种情况在数字PCR中读做单一计数）。“你告诉我你有多少小室或者多少液滴，（并且）它们中多大比例呈阴性。它就会基本上告诉我初始的浓度，这也将告诉我阳性小室与阴性小室的比例。”他说。
劳伦斯利弗莫尔国家实验室医疗诊断项目负责人Reginald Beer在研究生时发表了第一篇在单分散性（也就是说大小一致）液滴中进行数字PCR的报道。他说基于液滴方法的优势在于其可扩大性：增加反应容器的数量相对来说很简单，这样数据的质量也就随之增大。“当你扩大或增加了反应容器的数量时，泊松精度也就大大提升了。”他解释道。
这篇报告的发表建立了Bio-Rad和RainDance的数字PCR平台的效能，以及数字PCR可扩展应用的多样性。例如，RainDance公司的平台已用于检测神经胶质瘤患者的脑脊髓液中突变基因的转录本，和来源于直肠癌患者血清中的KRAS突变。
FHCRC成员Jason Bielas使用Bio-Rad的系统去定量分析卵巢癌中肿瘤渗透的淋巴细胞，而美国华盛顿大学实验医学系病毒学主任与教授、FHCRC成员Keith Jerome则用其研发了一种方法，使其能够区分活性HHV-6病毒血症和整合基因组的潜在病毒。（如果发生在骨髓移植的过程中，必须处理前者而非后者；二者通过病毒序列拷贝数与血液中对应基因组的比例进行区分，在基因组整合的情况下应为1.0。）
Bielas表示，他的团队能够使用他们自创的QuanTILfy方法，能够可重复地分解甚至是10000个癌细胞中的1个T淋巴细胞（足以检测T细胞肿瘤扩散与患者存活之间的联系）。这种方法与当前标准的免疫组化方法相比更加量化，他解释道：“本质上，你是对T细胞基因组进行计数。”
斯坦福基因组技术中心高级副主任Hanlee Ji也在使用Bio-Rad系统来验证基因组测序研究中的遗传偏差，近期也用于在测序前对下一代测序文库的对照样品进行定量。对他的团队来说，数字PCR的优势在于其简易性：他可以在几周内让一个本科生在实验室中学会操作数字PCR，而实时定量PCR花费的时间则会长很多。
“我对技术的一项测试是：如果我让一个具有实验技能的本科生坐在一台仪器面前，他们能否在几周的时间内按要求从阳性和阴性对照中得到正确的结果？如果可以，就说明这个系统很好用。”
数字PCR与测序
2011年，Kinzler和Vogelstein提出了另一项用于稀有等位基因检测的数字PCR方法，这一次是基于测序。这项安全测序系统（Safe-SeqS）的策略需要将每个模板分子标记独特的标示物（或者条形码），然后进行扩增并由下一代DNA测序进行读取。
约翰·霍普金斯Ludwig中心转化遗传学部主任、约翰·霍普金斯医学研究所肿瘤学教授Nickolas Papadopoulos是该研究的共同作者。他认为，比起BEAMing来，Safe-SeqS能让研究者将数字PCR的能力扩展到更多位点——达到30个甚至以上。
“大规模平行测序代表了一种极其强大的数字PCR形式，亿万个模板分子能够得到逐个分析。”Papadopoulos及其共同作者在2011年的研究中解释道。“它的优势超过了传统的数字PCR方法，其中多重碱基可以得到依次、简便的自动化检测。”但是由于扩增、测序和检测中的错误，下一代测序技术的固有误差率高得让人难以接受。通过在每个起始分子上的独特标示物，Safe-SeqS可以使研究者区分真正的突变和程序化的人为错误。
在最初的研究中，作者评估了10万个正常人细胞中CTNNB1基因的突变。原始Illumina测序读取的错误率为2.1×10-4。Safe-SeqS条码标签可以将这一比率降低24倍，达到9×10-6。在用于线粒体DNA时，Safe-SeqS能将观测错误率降低15倍。
过去的一年中，该团队将Safe-SeqS扩展到在常规巴氏试验的刮宫材料中寻找卵巢癌、子宫内膜癌和宫颈癌的多重信号，这是研发妇科肿瘤早期检测系统的第一步。在这个例子中，该团队使用这一分析方法从12个癌症相关基因中评估了46个基因区域的突变。
近期在美国圣地亚哥举行的数字生物学会议上，Papadopoulos讨论了这一方法。他说，Safe-SeqS可能会对血浆的肿瘤早期检测十分有用。总体上，他的团队能够在超过80%的肿瘤血浆样品中检测到突变。但是一些肿瘤型的表现比其它的要好。他说，尤其困难的是脑部的恶性肿瘤，“目前，我们仅能从10%的具有这种肿瘤型的患者血浆中检测出突变”。
基于阵列的策略
对于美国罗格斯大学动物科学院助理教授Andrzej Pietrzykowski来说，数字PCR的精确性对他尤其有益，他研究酒精成瘾的分子和遗传基础。他看到的很多变化都小于2倍，难以被实时定量PCR所识别。他说，这一差别已经可以在数字化中检测到。
Pietrzykowski也提到了另一项优点。他鉴定的一个特定小RNA可能与酒精成瘾相关，而且能够使用实时定量PCR来量化这一分子。但用实时定量PCR分析方法对于小RNA的前体来说却难以完成，因为给标准曲线标定确定可靠的对照是有问题的。“你需要两次或三次检查那些不随环境变化的看家基因。”这对于数字PCR来说不是问题，因为这项技术不需要标准曲线。
Pietrzykowski是生命技术公司数字PCR应用基金项目中五大创新基金获得者之一，就在2013年末，他获得了该公司的QuantStudio 3-D芯片读取器、芯片上样器和热循环仪。QuantStudio 3D数字PCR系统就像Kinzler原始数字PCR的大马力升级版。研究者使用了一种近似于挡风玻璃“橡胶滚轴”的工具将样品离散在2万个蚀刻在硅片表面的小孔中。Fluidigm公司也使用这一物理矩阵的策略，他们的qdPCR 37K系统“整合流动回路”提升了该公司的微流控专长，可将48个样品逐个分布在770个小室中（尽管每个样品能够分散在多组小室中提高正确率，达37000个）。
对于越来越多的特定（常常是临床）应用而言，这一技术明显具有诸多优势。但先不要抛弃你的实时定量热循环仪。对于大部分研究者来说，数字PCR可以是实时定量PCR的补充，而不是替代。的确，Beer说，对于许多应用而言实时定量PCR“目前足矣”，而且，这一技术更加成熟并且方法也建立起来了。“从通量的角度来看，实时定量PCR仍具有显著优势。”生命技术公司（近期被赛默飞世尔科技公司收购）数字PCR高级产品经理Iain Russell表示，“坦率地讲，它可以满足市面上大量应用的客户需求。”
“这确实取决于你提出的问题。”Pietrzykowski说。■
（译者之一高大海系中国科学院海洋研究所助理研究员）
Jeffrey M. Perkel 是美国爱达荷州波卡特洛的科学自由撰稿人。
鸣谢：“ 原文由美国科学促进会（www.aaas.org）发布在2014 年4 月11 日《科学》杂志”。官方英文版请见http://www.sciencemag.org/site/products/lst_20140411.xhtml
鸣谢：“ 原文由美国科学促进会（www.aaas.org）发布在2014 年4 月11 日《科学》杂志”。官方英文版请见http://www.sciencemag.org/site/products/lst_20140411.xhtml
《科学新闻》 (科学新闻2014年8月刊 科学·生命)
https://blog.sciencenet.cn/blog-85876-826048.html
上一篇：常规育种可实现中国玉米自足
下一篇：Science8月1日刊
扫一扫，分享此博文
全部作者的精选博文
- • 干细胞技术卡在最后一公里
- • 大麻的科研诱惑
- • 高考志愿填报之我见
- • 全球维度下的交叉学科
- • 交叉学科之困
- • 王鼎盛：资助越多，国内发文越少