链球菌溶素O(streptolysin O,SLO;肽链长571aa)属于细菌膜穿孔蛋白家族(family of poreforming proteins)，由于这个家族绝大多数成员的膜受体都是胆固醇，所以命名为“胆固醇依赖溶细胞毒素家族(cholesterol-dependent cytolysins,CDCs)”。除SLO外，CDC家族还有肺炎球菌溶素O(pneumolysin O, PLY;471aa)、产气荚膜杆菌溶素O(perfringolysin O,PFO;499aa;θ毒素)、李斯特菌溶素O(listeriolysin O,LLO;529aa)、斯氏李斯特菌溶素(seeligeriolysin,LSO;530aa)、蜂房杆菌溶素(Alveolysin,ALY;512aa)、腊状溶素O(Cereolysin O,CLY,509aa)等二十几种。CDC家族中大多数毒素的氨基酸序列、结构域及其分子构象均已清楚。CDCs有几个共同的突出特点：    

一、分子构像类似L回飞棒形

以PFO为例（图1），结构域D1(37–53,90–178,229–274,350–373aa)可能与D2一道起聚合作用以及促使D3插入细胞膜脂质层；D2(54–89,374–390aa)结构域通过一个甘氨酸(Gly392)与D4连接, 此外D2与D4之间的带电荷氨基酸(Lys⁷⁰-Glu⁴⁴⁶)可借硫酸盐形成离子键(SO22—)相连；在D4区与胆固醇结合后，D2可变构；D3(179–228,275–349aa)含2个α-螺旋集束，形成两性“跨膜发夹结构(transmembrane β-hairpin, TMH)”(TMH1:190–217aa;TMH2:288–311aa)，已证实TMH是CDCs插入细胞膜内结构；CDCs肽链C端为D4区(392–499aa)，是一个紧凑的β-桶状区，几乎所有的CDCs-CD4都有一个非常保守的富含色氨酸(Trp,W)11肽段(undecapeptide:^NH2-ECTGLAWEWWR^-COOH)形成的襻结构^[3]。    

 二、膜受体一般为胆固醇    

 CDC家族均大多数成员以膜胆固醇为黏附受体，CDC依靠D4区的11肽襻C端富含Trp序列和间隔22aa的L1环的2个保守“Thu-Leu对”^[4]（参见表1）合起来构成胆固醇结合位点与胆固醇结合。CDC单体分子的D4区识别膜胆固醇，结合在含高密度胆固醇的膜表面。结合后，与D4紧连的D2区变构，从而引起D1变构并挤压D3。D3受挤压后也改变空间构像，暴露两性TMH结构并使其插入细胞膜内。D1和D2区变构后也暴露聚合区，使得若干(>50)单体分子在细胞膜内互相聚合成跨膜中空聚合体（图2）^[5]。        

现已证实中间链球菌溶素O(intermedilysin,ILY;532aa)和阴道加德纳菌溶素(Vaginolysin,VLY:516aa)是例外，它们的11肽襻及T-L与其它CDCs的一样可与胆固醇结合，但只是介导单体分子聚合，不能导致膜损伤。它们的主要膜受体是人类CD59（即阻止补体攻膜复合体形成的“膜反应性溶解抑制物”）。以胆固醇作为膜受体的CDC可识别结合人与动物细胞，而以人CD59为受体的ILY和VLY只能识别结合并溶解人细胞。Polekhina等将ILY-D4与PFO-D1/2/3拼接在一起，嵌合体PFO^ILY-D4竟只能溶解人细胞；而将PFO-D4与ILY-D1/2/3拼接在一起，嵌合体ILY^PFO-D4则既能溶解人红细胞又能溶解马红细胞^[6]，这说明识别细胞决定于D4区。Hughes等人证实：ILY-D4区与11肽的C末端紧接的9肽序列（⁴⁹⁴WRLIYSKND⁵⁰²，见表1-D画虚线序列）与补体C9的249—257aa区段同源，也像C9一样可与人CD59的42—58aa区域结合^[7]。    

CDCs单体分子与膜受体结合后，有两种聚合方式：一是以PFO为代表，单体分子黏附胆固醇后插入膜浅表（或锚定在膜表面），单体分子在膜表面聚合后再插入膜内（图3左A）。这种聚合方式，膜表面形成的CDCs聚合物未插入膜内时称为“前孔(prepore)”，插入膜内后称为“孔(pore)”；二是以SLO为代表，首先是1个或极少几个单体分子与膜胆固醇分子结合后插入膜内，然后其它单体分子以此为基点依次线性植入膜内，排列成弓形（图3左B）。弓形聚合物形成后，可能在其相对的游离边发生“切割”，细胞膜上出现弓形损伤，最终导致规则或不规则的环形损伤。在电镜下，可见细胞膜上出现1个由许多（40～125个）单体分子聚合形成的冠状双层，即外层环的单体分子疏水面朝外、内层环的单体分子亲水面朝内的大孔径（φ～25nm）跨膜孔（图3右）^[8]，比葡萄球菌溶血素α-Hly七聚体和补体攻膜复合体的跨膜孔都大，甚至允许蛋白质等大分子轻易外泄，最终导致细胞溶解。

三、有分子氧(O₂)存在时可逆性失去溶细胞毒性    

在有游离氧分子存在时，毒素可逆性失去溶细胞毒性，加入还原剂（半胱氨酸或硫醇等）又重新恢复溶血毒性，故CDCs也称之为“硫醇活化溶细胞毒素家族（thiol-activated cytolysin，TACY）”。    

国内几乎所有（怕自己读书太少不敢说全部）的医学微生物学教科书都是一种解释：SLO对O₂敏感，遇到O₂时，SH基被氧化为-S-S-基（二硫键），失去溶血活性。若加入还原剂，二硫键还原，溶血作用可以逆转（不引用文献了，读者随便找一本大学医学微生物学教科书，翻到“A群链球菌”一节，准能看到相同内容）。记得有一本著作有一张图还画出了SLO二硫键的位置（恕不引文献），我模拟画了一张类似图（见图4）。    

要说这种解释也有道理。例如，Hotze等人用氨基酸定位替换技术，将PFO的D2区的Gly⁵⁷替换为Cys(G57C)、D3的TMH1区的Ser¹⁹⁰替换为Cys(S190C)，获得了替换突变型PFO^C57-C190(图5)。这种带二硫键的突变型PFO^C57-C190可以与膜胆固醇结合并在膜表面形成聚合物前体(prepore),但不能插入膜内造成溶血。在加入还原剂还原二硫键后,前体聚合物即插入膜内成孔(pore)^[9]。Palmer等人也构建了一个T250C突变型SLO，含两个半胱氨酸（Cys²⁵⁰和Cys⁵³⁰），这一突变SLO也没有溶血性^[10]。 

早在1987年，Walker等人就完成了肺炎球菌溶素O(PLY)的测序，结果发现PLY肽链长471aa，一级序列中只有1个Cys^428[11]。紧接着Kehoe等人也完成了链球菌溶素O(SLO)的测序，结果发现SLO肽链长571aa，一级序列中也只有1个Cys⁵³⁰，没有2个（见图1右）！估计作者们对只有1个Cys也有点吃惊，特意用黑框将Cys醒目框住^[12]。现如今，已发现的CDCs家族的所有毒素几乎都已经测序，绝大多数毒素肽链只有1个Cys（表1-A组），而PLO、ILY和VLY三种毒素甚至1个Cys也没有（表1-C/D组)，唯独只有ILO有2个Cys(C⁴⁸³/C⁵⁰⁹；表1-B)。CDCs的肽链最多只有1个“Cys-SH”(巯基)，不可能形成肽链内二硫键。

此后不久，Pinkney等人用定位突变技术，将SLO-Cys⁵³⁰密码子TGC，分别置换成GCC(Ala)得到突变型SLO^A530、以及置换成TCG(Ser)得到突变型SLO^S530。通过溶细胞实验发现，两种突变型溶素的溶细胞活性与野生型溶素没有显著性差异，而且组装的跨膜聚合体都相同，溶细胞活性都能被游离胆固醇分子所抑制。以至于作者们在标题上就断然说“SLO的溶细胞活性不需要巯基”^[13]。     

国外有些学者对待学术就是严谨，为了让疑惑者彻底无话可说， Polekhina等人用扫描替代突变法，用Ala分别替换PFO-11肽的10个氨基酸（除序列内原来的Ala），获得10种突变型PFO。将这10种突变型PFO分别与野生型PFO比较细胞结合活性和溶细胞毒性，发现PFO^E458A和PFO^C459A突变型与野生型相比，细胞结合活性和溶细胞毒性均无明显影响，这说明没有Cys的PFO其活性不受影响；其余突变型PFO与野生型相比，细胞结合活性和溶细胞毒性均大受影响，几乎完全没有溶细胞毒性（图6左）。他们还用同样的方法获得了11种突变型ILY（如原序列是Ala就换成Gly，如原序列是Gly就换成Ala，图6右），结果发现保守11肽任何位置氨基酸残基的改变，对毒素的细胞结合活性均无显著影响；但两个色氨酸(W)的突变型ILY^W491A和ILY^W494A，它们的溶细胞毒性几乎完全灭活。这一研究表明，保守11肽的Cys是否存在，对CDCs的细胞结合活性和溶细胞毒性无任何影响，倒是11肽C端氨基酸残基（尤其是色氨酸）的改变对毒素活性影响甚大^[6]。此外，Gelber等人制备了VLY的11肽替换突变型VLY^P480W，这种突变VLY也没有溶细胞毒性^[14]。这很有意思，VLY^P480W突变型11肽的脯氨酸（P）换成色氨酸（W）后，其11肽序列C端的5个氨基酸残基就与SLO等一样了（表1-A），但怎么反而丧失了溶细胞活性呢？   

Watanabe 等人研究了李斯特菌溶素(LLO)等几种CDCs对小鼠的致死毒性。野生型LLO对小鼠显示强致死效应，而ILO的致死毒性稍微弱于LLO，SLO和PLY则明显弱于LLO。而只含有D1-3结构域（1-415aa）的LLO没有致死效应和溶细胞毒性，这证实了D4是发挥毒素活性必需的结构域。作者用定向突变技术制备了4种突变型LLO：替换11肽Cys的突变性LLO^C484S，显示溶细胞毒性轻微减弱，小鼠致死效应未受影响；但是11肽的3个色氨酸突变型LLO，其中LLO^W489A和LLO^W491A没有显示任何致死效应和溶细胞毒性，而LLO^W492A的溶细胞毒性严重衰减，但仍保留一定的致死效应（注射10只小鼠，死了6只）^[15]。这一研究表明，在D4区保守的富含Trp的11肽中，Cys对毒素活性几乎无影响，而3个Trp则对毒素活性起着关键性的作用。    

生脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes)溶素(pyolysin,PLO;534aa)的11肽也没有Cys（表1-C），但它与ILY及VLY不同，是以胆固醇为膜受体。它与ILY还有一个特殊之处，对O₂不敏感（即抗氧化作用）。更有意思的是，Billington等人将PLO的11肽第2位丙氨酸(Ala⁴⁹²)替换成Cys，突变型PLO^A492C的11肽（EC⁴⁹²TGLAWDPWR）与其它带Cys的野生型CDCs基本相同，但突变型PLO^A492C与野生型PLO均对O₂不敏感。有Cys也对O₂不敏感，这完全颠覆了现有教科书有关“Cys对O₂敏感”的认识^[16]。  

    

结语    CDCs肽链中最多只有1个Cys，所以不可能形成链内二硫键。保守11肽第2位是Cys的CDCs将此Cys替换成其它氨基酸、或原来在11肽第2位没有Cys的CDCs在此位换上1个Cys，其细胞结合活性和溶细胞毒性与野生型CDCs无异。证实原来关于“氧化态SLO形成二硫键而失去溶细胞毒性”的解释是错的！笔者在10年前就曾指出SLO等“巯基活化毒素的溶血性与巯基的氧化或还原无关”^[17]，并且有一段阐述文字与图，但由于某种有中国特色的原因被人模糊处理了。不过我仍时时期待着有哪位作者能将“医学微生物学”教材中的这个陈年错误改正过来，惜至今（至少在主流教材中）不曾见到。国内的“医学微生物学”与“医学免疫学”教材大多互相抄袭的现状何时能有改观？中国的医学生幸甚！ 

 

   参考文献

[1]  Rodney K. Tweten: Infect Immun. 2005,73(10):6199–6209;

[2]  Michael A. Meehl and Michael G. Caparon: Molecular Microbiology,(2004),52(6):1665–1676;

[3]  Jamie Rossjohn,et. al.: Cell,1997,Vol.89(5):685–692;

[4]  Allison J. Farrand, et. al.: PNAS, 2010,Vol.107(9):4341–4346 ;

[5]  Mélanie Anne Hamon: Trends in Microbiology, 2012,Vol.20(8):360–368;

[6]  Galina Polekhina, et. al.: PNAS, 2005,Vol.102(3):600–605;

[7]  Timothy R. Hughes, et. al.: Mol Immunol.,2009,Vol.46(7):1561–1567;

[8]  Alejandro P. Heuck,et. al.: JBC,2003,Vol.278:31218–31225;

[9]  Eileen M. Hotze,et. al.: JBC,2001,Vol.276:8261–8268;

[10] Michael Palmer, et. al.: The EMBO Journal,1998,Vol.17(6):1598–1605;

[11] John A. Walker, et. al.: Infection and Immunity,1987, Vol.55(5):1184–1189;

[12] Michael A. Kehoe, et. al.: Infection And Immunity,1987,Vol.55(12):3228–3232;

[13] Michael Pinkney, et. al.: Infection and Immunity,1989,Vol.57(8):2553–2558;

[14] Shari E. Gelber, et. al.: J. Bacteriol.,2008,Vol.190(11):3896–3903;

[15] Isao Watanabe, et. al.: J. Med. Microbiol.,2006,Vol.55(5):505–510;

[16] Stephen J. Billington, et. al.: J. Bacteriology, 1997, Vol.179(19):6100–6106;

[17] 龙北国、江丽芳主编《高级医学微生物学》，人民卫生出版社，2003年第1版，第41页。