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淋巴细胞“阴性选择”或另有玄机
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免疫系统必须能够正确区分“自己”与“非己”、并且对自身固有成分耐受才能达成自身稳定。免疫系统的自身耐受是如何产生和维持的？尽管还有许多不明之处，但至少以下三种理论解释还是获得了实验证据支持或许多学者赞同的（为方便，此处只引用龚非力教授的著作）。
一是Burnet（1957年）克隆选择学说，认为在胚胎期形成的淋巴细胞克隆，若与相应自身抗原接触，便作为“自身反应性淋巴细胞（autoreactive lymphocyte，ARL）”被清除，故成年个体的淋巴细胞仅识别非己抗原并对其产生应答，而对自身抗原则产生耐受[1]。
二是对隐蔽抗原的认识。体内某些器官或组织（如血脑屏障、眼前房、睾丸等）内的某些抗原成分，在正常情况下不与免疫细胞接触，在胚胎期也未与免疫系统接触过，称为隐蔽抗原（sequestered antigen），针对隐蔽抗原的相应特异性淋巴细胞克隆未在胚胎期被消灭。若隔绝屏障被打破，这些隐蔽抗原可释放入血，激活相应ARL，导致自身免疫病发生[2]。
三是淋巴细胞在即将成熟前，都要经历中枢免疫器官的“阴性选择(negative selection)”机制甄选，即如果B细胞BCR与骨髓细胞表达的自身抗原分子、T细胞TCR与胸腺内树突状细胞（DC）和巨噬细胞（Mφ）通过MHC分子提呈的自身抗原肽能识别且高亲和力结合，这些ARL可被再编辑、凋亡或失能[3]。
以上三种解释是互相关联的，可以认为是阐述自身免疫耐受的核心理论。但仔细分析与思考这些解释，还是发现了一些难解的疑惑。
疑惑一，如果存在淋巴细胞未能识别的、位于特殊隔绝屏障内的隐蔽自身抗原，那就意味着，必定有原本可识别这些隐蔽抗原的ARL，到过这些隔绝部位且吃了“闭门羹”。但现在的“阴性选择”理论又认为：ARL还未成熟就在中枢免疫器官内被清除了。那么，ARL连“出生”的机会都没有，还能走出中枢免疫器官去“探访”隐蔽抗原的居所？
对这一矛盾的唯一合乎逻辑的解释就是：在胚胎期，胎儿的中枢免疫器官尚未建立（或未健全）阴性选择机制，所以此时在中枢免疫器官内成熟的淋巴细胞，可以不受限制的出去“周游”全身。阴性选择机制应该是在胎儿即将出生时或出生后开始建立的。
疑惑二，现在的理论思维是：在胚胎期，ARL通过膜抗原受体与自身固有成分一一识别后而被禁忌的。理所当然，出生后阴性选择时，新生淋巴细胞也应该是与中枢免疫器官“出口”处的抗原提呈细胞（antigen-presenting cell，APC）所提呈的自身抗原肽逐一识别，甄别为“非自身反应性淋巴细胞（non-autoreactive lymphocyte，NARL）”后，才能走出中枢免疫器官。这一理论解释的主要依据是，中枢免疫器官存在许多高表达MHC分子的APC。我之所以质疑这种解释，是因为按照这一解释，阴性选择的“工程”规模可能令人难以置信的繁复浩大。不信？在此先做几个粗略的估算。
第一，人体大概有多少种自身抗原肽？
“什么是‘自身’，生物学中的定义是：机体胚系基因（gene in germ-line）的编码产物。免疫学中还要加一条：机体免疫系统发育过程中遭遇过的物质。[4]”在此做个简单的估算：据人类基因组研究结果估算，人类大约有25000个胚系基因，专家们认为每个胚系基因大概与3～10种蛋白质相关。即体内除存在以胚系基因序列原样直接表达合成的肽链外，还有更多的由不同细胞依靠胚系基因拼接重组构成的体细胞基因表达合成的肽链。因此，保守估计人体固有成分的蛋白质分子应该有10万种左右。假如每种蛋白质分子携带的表位或能被提呈的抗原肽约有3～5种的话，自身抗原肽可达几十万种。从主客关系来看，这就意味着，中枢免疫器官内执行阴性选择任务的APC（或其它细胞），必须准备几十万种自身肽来甄别ARL。
第二，参与阴性选择的APC如何获得这几十万种自身抗原肽？
由每一个APC“周游”全身从每一种细胞那儿采集来？好像目前没有哪位研究者发现APC犹如蜜蜂采蜜般在体内穿梭忙碌的迹象。那么或由APC利用细胞核内的基因组合成？如果APC自己（或基质细胞）合成，最多只能正确合成利用胚系基因原样直接表达的25000种肽链，还有更多的由体细胞基因表达的自身肽链，APC如何能保证正确合成？简直让人难以置信！如果真能合成，APC就成“多能干细胞”了。也难怪，至今未见哪位研究者，将这种由膜表面“展示”几十万种自身抗原肽的APC构成的、中枢免疫器官“出口甄选滤过”的解剖结构指给我们见识见识。
第三，APC的MHC分子能提呈几十万种自身肽吗？
退一步说，就算有其它细胞为参与阴性选择的APC准备好几十万种自身肽，但APC的MHC分子能提呈这么多的自身肽吗？每一个人的HLA胚系基因都是父本母本双单元型共显性表达，其中经典HLA-Ⅰ类A、B、C分子共6种，HLA-Ⅱ类分子最少只有DP和DQ分子各4种、DR分子6种（包括顺式与反式组装）[5]。每一种HLA分子能依靠2～4个锚定位（pocket）识别结合抗原肽的锚定残基（anchor residue）。即使包容性再大，也很难设想，APC仅仅依靠区区20～30余种经典HLA分子，能完成提呈“几十万种自身抗原肽”、即1种HLA分子提呈约1万种自身抗原肽的艰巨任务！
第四，面对几十万种自身抗原肽，阴性选择机制如何确保均等甄选机会？
现在的阴性选择理论认为，在中枢免疫器官内，未成熟淋巴细胞通过抗原受体识别APC提呈的自身抗原肽后，才能甄别它是不是ARL。因此，为了确保没有1个ARL成为“漏网之鱼”，在理论上就要确保每1个新生淋巴细胞，都能用其抗原受体与这几十万种自身抗原肽一一接触识别（均等机会），才可能甄别无误。面对几十万种抗原肽，每1个淋巴细胞对每1种抗原肽如何能确保精确无误地一一识别？更何况若从主客关系考虑，APC是识别主体，新生淋巴细胞是被识别的客体。据专家说，成年人体内约有1012个淋巴细胞克隆，也就是说，中枢免疫器官必须准备一种由提呈有几十万种自身抗原肽的APC组成的“出口甄选滤过器”，让那1012个淋巴细胞“排着队”挨个被一一识别（似乎有点夸张，但如果1012这个数是外周血的淋巴细胞数，那么在阴性选择时，“甄选滤器”要面对多出几十倍的未成熟淋巴细胞。所以还可能估计不足）。如此繁琐复杂的甄别方式，阴性选择要保证每个新生淋巴细胞获得均等的甄选机会，真令人难以置信。
通过上述估算可知，中枢免疫器官若果真采用如现行理论解释那样的阴性选择机制，很可能力所不能及。即使能勉强执行，也可能是高耗费且低效率的。在适者生存竞争的生物进化过程中，任何生物都倾向于以最小的耗费、最简单可靠的高效机制，去获取对自身发展有利的最大效益。因此很难想象，进化到生物界顶端的人类，竟然“择优选择”了如此繁琐复杂、耗费大且难以保证均等甄选机会的、且“性命攸关”的阴性选择方式？
因此我认为，中枢免疫器官对未成熟淋巴细胞进行的阴性选择或另有玄机。
通过基因测序已基本知道，参与淋巴细胞抗原受体基因重排的VH、VLκ、VLλ、Vα及Vβ胚系基因总共大约500余个。但淋巴细胞们通过设计精巧的BCR基因的VH-D-J及VL-J基因拼接、或TCR基因的Vα-J及Vβ-D-J基因拼接，这寥寥数百个基因可拼接成数以亿计的独特V区基因，最终可翻译合成超出数以百亿计的、具有独特V区的BCR和TCR。每一个BCR和TCR的V区都呈β折叠桶状构象，其顶端有1个抗原结合腔，每1个抗原结合腔由3个互补决定区（complimentarity determining regions，CDR）决定其独特的分子构象。这说明，BCR与TCR依靠较保守的骨架区（framework regions，FR）保证V区整体结构的稳固，依靠变化多端的CDR（尤其是CDR3）构成的抗原结合腔，满足淋巴细胞们识别难以计数的抗原表位或抗原肽的需要。因此，按现行理论解释，在中枢免疫器官内进行阴性选择时，实际上是APC通过膜表面提呈的几十万种自身肽，去一一识别超出数以百亿计的各种淋巴细胞的抗原受体，即去一一识别数目更多的淋巴细胞抗原受体V区的独特CDR（CDR-Id）。
那么，免疫系统有必要采用这种繁复浩大的阴性选择“工程”吗？中枢免疫器官为什么不能反向思维一次呢？
淋巴细胞们通过胚系V区基因重排后制造的CDR-Id种类虽然超出数以百亿计，但制造的骨架区独特表位（FR-Id）却可能不超过千种。为什么不能是：参与阴性选择的APC，不提呈自身抗原肽去识别淋巴细胞抗原受体V区变化莫测的CDR-Id、而是另选某种分子去识别较为保守的FR-Id呢？况且，似乎正好有一类蛋白质分子可以承担这一重任，岂非“天意”？
我认为可以承担甄选ARL重任的蛋白质分子，很可能就是与“超抗原（superantigen，SAg）”性质相似的分子。
迄今为止的SAg研究成果可谓浩如烟海，很难让人一一枚举，但以下几点似乎很有意思。
其一，SAg是一种双结合分子，有两个结合结构域，一个可以与MHC分子抗原结合槽外部结合，另一个可同时与淋巴细胞抗原受体V区外部结合，结合后既可激活MHC表达细胞，也可激活淋巴细胞[6]。
其二，SAg一般与TCR-Vβ区的CDR1-FR2、CDR2末端-FR3和1个称为“第4超变区（fourth hypervariable region，HVR4）”的侧环结合、或者与BCR-V区的FR1和CDR2末端-FR3区结合，尚未发现与CDR3结合的事例；
其三，不同的SAg可选择识别结合不同的（1个或几个）V区。如超抗原葡萄球菌肠毒素A（Staphylococcal Enterotoxin A，SEA）选择性地与由VH3基因构成的BCR-V区结合，不与VH4构成的BCR-V区结合[7]。而SED正相反，只与VH4构成的BCR-V区结合，不与VH3基因构成的BCR-V区结合[8]；
其四，SAg可调控未成熟淋巴细胞在抗原受体基因重排时选择表达胚系V基因。例如消化链球菌L蛋白（超抗原），可选择性地与由Vκ1、Vκ3和Vκ4基因编码合成的Ig-V区FR结合。Muriel Viau等人用L蛋白免疫带有人Ig基因（VL基因是1～5Vκ）的转基因小鼠，发现L蛋白不影响小鼠骨髓中pro-B至pre-B的发育进程，却影响pre-B细胞选择表达Vκ基因，结果在小鼠脾细胞中未检测到Vκ1和Vκ3基因（被删除了）[9]。Jenkinson等人在体外培养的胸腺基质细胞培养液中，加入SEE后迅速导致Vβ8+T细胞被完全清除[10]。
上述研究成果说明：① SAg可以与MHC结合，说明APC可以利用MHC结合SAg；② SAg同时可以结合抗原受体V区，说明APC可利用SAg识别淋巴细胞抗原受体的V区；③ SAg只与抗原受体V区外部、主要是“CDR2末端-FR3区”结合，正好是较保守的FR-Id；④ SAg可以影响未成熟淋巴细胞选择表达V区胚系基因，并且可删除被其识别的V区基因，正好满足阴性选择的需要。
很早就有研究者发现，内源性SAg可能引起T细胞的克隆删除（clonal deletion）。Kappler等人发现，MHC-E+小鼠的MHC-E分子可提呈鼠乳腺瘤病毒抗原mtv（内源性SAg），导致单阳性（SP）Vβ17+胸腺细胞被清除（双阳性胸腺细胞不受影响）；而在MHC-E-小鼠体内，由于没有提呈mtv的MHC-E分子，所以Vβ17+胸腺细胞数目正常[11]。这说明内源性SAg可导致已通过阳性选择的（SP）Vβ17+胸腺细胞在阴性选择机制中被清除。
我由此推测：执行阴性选择的细胞，或许是利用一类性质与超抗原相似的调控分子，识别结合那些构成“自身抗原识别受体”V区的FR-Id，从而甄别ARL并清除之。谨在此提出以下推测与假设：
一、在胚胎期，可能发生以下事件：
（一）胎儿中枢免疫器官未建立阴性选择机制，所有新生淋巴细胞可不受限制地进入血液循环。在体循环期间，凡是抗原受体识别结合了抗原（自身固有成分抗原或进入体内的异种抗原）的淋巴细胞，会回流中枢免疫器官，被某种基质细胞将其标记为“自身反应性淋巴细胞（ARL）”，并记录其V区FR-Id（尤其是FR3）的特征性信息，然后按以下方式分别处置：
1. 所有BCR和TCR的胚系V区基因都是功能性基因，都能参与V-D-J或V-J基因重排。当某个胚系V区基因被ARL采用的频次过高时，该基因会被免疫系统判定为“高危V基因”，被禁忌成为假基因（已知约占V区基因数的50%）；
2. 如果某个V区基因虽被ARL采用过，但频次未达到高水平，说明NARL也有一定的采用频率，为有利于出生后应对非己抗原，该基因被保留。但其FR-Id特征信息，会作为一种自身抗原受体标识（autoantigen receptor marker，ARM），被基质细胞记录并逐步建立起ARM“档案”（由于高危V区基因已被禁忌，另有一部分应该是NARL高频次采用的V区基因，所以作为ARM的FR-Id数目估计仅有数百个）；
（二）基质细胞根据ARM“档案”信息，逐步建造“ARM甄选分子（ARM selectin，ARMS）”的体细胞基因库。ARMS具有双识别结构域：一个结构域可与MHC分子抗原结合槽外部连接，另一个结构域可识别结合ARL抗原受体V区的ARM（FR-Id）（1种ARMS可能可以识别1～几种FR-Id，因此ARMS基因库大约只要百余个基因就够用了）。
二、胎儿出生时（或胚胎晚期），中枢免疫器官开始建立阴性选择机制。大概有三类细胞参与阴性选择：
一是ARMS合成细胞。推测应该是中枢免疫器官中建立了ARMS基因库的基质细胞，由这些细胞合成ARMS分子。
二是ARM识别细胞。推测应该是表达MHC的基质细胞和DC。它们通过MHC分子选择结合对应ARMS（20余种MHC分子选择大约百余种ARMS分子，应该应对自如了），然后用ARMS甄别新生淋巴细胞。凡抗原受体V区的FR-Id能被ARMS识别结合，该未成熟淋巴细胞即被甄别为ARL，并促使其进行受体修正。凡抗原受体V区的FR-Id不能被ARMS识别结合，该未成熟淋巴细胞即被甄别为NARL，可进入外周免疫器官。
三是ARL清除细胞。推测应该是Mφ。如果ARL受体修正无法进行或不成功，则Mφ通过ARMS识别ARL的抗原受体而被激活，可诱导ARL凋亡或吞噬清除之。
结语 我认为，人体内应该存在一类性质与SAg相似的淋巴细胞抗原受体V区基因重组调控因子（本文暂时命名为“ARM甄选分子”）。正常情况下，ARMS只由中枢免疫器官的基质细胞合成，仅在中枢免疫器官内发挥调控作用（包括阴性选择）。而细菌和病毒在与宿主“斗争”时，发现了宿主这种调控淋巴细胞发育的奇妙分子，因此采取“分子模拟”或直接“盗取”ARMS基因的手段，合成了所谓SAg，用它来扰乱宿主的免疫功能，以利于其感染。本文提出的几点推测与假设，如果日后证明基本是事实，不但可以较好地认识淋巴细胞阴性选择机制，而且也可较好地解释为什么在胚胎期及幼龄期更容易建立免疫耐受，或许对治疗自身免疫病也有所贡献。
但愿，我不会错得太离谱！要真错得离谱，就权当引玉之砖吧。
参考文献
[1] 龚非力主编《医学免疫学（研究生教学用书）》，科学出版社，2009年第3版，第138页;
[2] 龚非力主编《医学免疫学（研究生教学用书）》，科学出版社，2009年第3版，第235-236页;
[3] 龚非力主编《医学免疫学（研究生教学用书）》，科学出版社，2009年第3版，第126页，第117页;
[4] 周光炎主编《免疫学原理》，上海科学技术出版社，2007年第1版，第6页;
[5] Wikipedia：HLA-DR；网址 http://en.wikipedia.org/wiki/HLA-DR；
[6] 龙北国和江丽芳主编《高级微生物学》，人民卫生出版社，2003年第1版，47～49页;
[7] R. Domiati-Saad 和 P. E. Lipsky: J. Immunology, 1998,161(3):1257-1266;
[8] R. Domiati-Saad，et al.: J. Immunology, 1996;156(10):3608-3620;
[9] Muriel Viau, et.al.: Infect. Immun. 2004; 72(6): 3515–3523;
[10] Eric J. Jenkinson,et al.: JEM,1992,176(3):845-853;
[11] W. E.保罗编著，吴玉章等译《基础免疫学（上册）》，科学出版社，2003年第1版，772-773页。
https://blog.sciencenet.cn/blog-809009-629636.html
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