在新冠肺炎诊断过程中，核酸检测的目的是探测从患者体内采集的分泌物是否含有新型冠状病毒，从分子水平来说，就是去做核酸测序。核酸测序是鉴别物种、物种之间亲缘关系的权威手段，科学家也是通过这种手段来鉴别新型冠状病毒的，并据此分析其与引发SARS的冠状病毒的异同。

其实不只是核酸可以测序，蛋白质也可以测序。正如不同生物核酸中的DNA或RNA是由数量不等的不同核苷酸组成的一样，不同的蛋白质也是由数量不等的不同氨基酸组成的，这些核苷酸或氨基酸的种类与排列顺序，决定了核酸或蛋白质的特殊性。这样看起来，能够正确且高效地进行核酸或蛋白质测序，就显得非常重要。我们今天能够开展各种测序工作，很大程度上要感谢英国生物化学家桑格及其发明的测序方法。

图1  弗雷德里克·桑格

弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger，1918~2013）出生于英格兰格洛斯特郡，他的父亲是一位全科医生，早年曾在中国传教，母亲则是富商的女儿。在这样的家庭背景下，桑格对科学发生了兴趣。从比较开放的私立学校布莱恩斯特公学毕业后，桑格在1934年进入剑桥大学圣约翰学院学习，主攻当时还属于新兴学科的生物化学，并于1939年获得学士学位。1940年，桑格师从皮里（Norman Wingate Pirie）攻读博士学位，但不久导师就换成了纽伯格（Albert Neuberger）。他当时研究的是赖氨酸的代谢，并于1943年获得博士学位。此后桑格留在了剑桥大学，并进入奇布诺尔（Charles Chibnall）的实验室开始研究胰岛素，由此开始与胰岛素结缘。1954年，桑格当选英国皇家学会会员。

桑格选择胰岛素作为研究对象并非偶然，因为在当时胰岛素是少有的几种纯化蛋白质之一，且比较容易获得；而他所在的奇布诺尔实验室已经研究了多年胰岛素，具有了一定的研究基础；另外，当时已经发现了胰岛素的N端为苯丙氨酸，但胰岛素的完整结构还没有被破解。在前人研究的基础上，桑格建立了一套实验体系，他使用一种叫做2,4-二硝基氟苯（FDNB）的化合物做媒介。这种化合物后来被称为桑格试剂，当它结合在氨基酸链的N端会连接形成二硝基苯（DNP）化合物，经过水解之后，就可以形成黄色的DNP-氨基酸和其他氨基酸。由于不同长度的氨基酸片段质量不一样，使用纸层析技术，就可以将带DNP标记的氨基酸识别出来。如此反复多次，经过对比重复序列，就可以得到氨基酸链的排列顺序了。胰岛素是由两条链组成的，中间经过二硫键连接在一起，直到1955年，桑格及其助手才最终确定二硫键的位置。这样，整个胰岛素的测序工作就完成了。胰岛素是第一个被测定出结构的蛋白质，这为以后测定其他蛋白质的结构打下了基础，而这将有助于理解蛋白质的性质与功能，因此桑格的工作具有非常重要的意义，他也因为这项工作获得了1958年的诺贝尔化学奖。

1962年，桑格成为英国医学研究理事会分子生物学实验室的蛋白质化学部门主管，他开始将研究兴趣转向核酸的测序。核酸包括核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA），分别是由四种核苷酸和四种脱氧核苷酸组成的长链。自从沃森和克里克发现DNA的双螺旋结构以后，分子生物学就建立了起来，但是接下来的工作更为艰巨，因为要想了解核酸究竟是如何起作用的，就必须要探明其核苷酸的排列顺序。

桑格先是选择了比较短的大肠杆菌5S rRNA作为研究对象，采用与蛋白质测序类似的方法，在1957年测出来该RNA的序列。然后他又转向了DNA。DNA的测序比蛋白质和RNA都要复杂，在当时也没有多少可以参考的成果。从1973年开始，他与库尔森（A．Coulson）一起探索DNA测序的新策略，并在两年后提出了“加减法”模式，这种技术与蛋白质测序的裂解思维不同，而是引入了合成思维，通过核酸的合成来测定其组成。不过这种技术比较繁琐，误差比较大，还需要继续改进。桑格在实验中注意到，在DNA的合成过程中，不只是脱氧核苷酸可以加入到链中，与其类似的化合物也有可能加入。他想到组成DNA的是脱氧核苷酸（dNTP），如果使用双脱氧核苷酸（ddNTP），那么就会造成新链的终止。使用这种技术，可以得到长短不同的新链，由此就可以推断出其顺序了。实验证明，这种技术效果非常好。1977年，桑格正式提出这种双脱氧测序法，也被称为酶法或桑格法。1981年和1983年，桑格小组分别完成了人线粒体DNA和λ噬菌体DNA的测序。此后开展的人类基因组计划，也是根据改进后的桑格法开展的。由于这项成就，桑格与沃特·吉尔伯特和保罗·伯格一起分享了1980年的诺贝尔化学奖。

由于在生物大分子测序方面的成就，桑格成为唯一一位两次获得诺贝尔化学奖的科学家，他也是第四位获得两次诺贝尔奖的科学家。同时，在桑格的实验室，还培养出了其他几位诺贝尔奖获得者。

1983年，桑格正式退休，他要把机会留给后来的年轻人。桑格是一位十分谦虚的科学家，他说自己只是在实验室里瞎倒腾的人。不过，世人会记得桑格的贡献。尽管他没有直接参与人类基因组计划，他仍然被誉为“基因组学之父”。1993年，英国还成立了以他的名字命名的桑格中心（现为桑格研究院），那里不仅是人类基因组计划的重要研究基地，也是世界基因组学研究的中心之一。

图2  桑格研究院一角

    注：本文2020-3-20首发于“京师生物圈”微信公众号.