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1,ORF简介
开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)从起始密码子开始,到终止密码子结束的连续碱基序列,具有蛋白质编码潜能。由于密码子(codon)读写起始位点的不同,mRNA序列可能按照6种ORF阅读和翻译。如图1所示,对于序列1,可以从A开始读,也可以从T开始读,也可以从G开始读,因此一条序列上就有3种读码方式。同样的,互补链上也有3种,共6种ORF阅读方式。理论上,6种读码框都有“开放”的可能,但是现实世界中,生物体一般会使用不多于2个“开放读码框”。
图1. 6种读码框示意图
2,NCBI ORFfinder
ORF识别是确定哪种开放阅读框对应真正的多肽编码序列的过程。NCBI ORFfinder为最常用的ORF预测在线工具,使用也非常简单。
2.1,打开NCBI ORFfinder网站
在浏览器中输入网站:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/
图2. NCBI ORFfinder
2.2,粘贴序列并选择参数
Fasta格式文件是存储核酸或者蛋白质序列的一种标准格式。是以大于号“>”开头,后边接序列名字为第一行,其余行为序列的一种标准序列存储文件格式。如图所示:
图3. Fasta格式序列
这个文件中包含两条序列,一条是seq1,一条是seq2。
进行ORFfinder预测时,我们要将fasta格式的序列拷贝粘贴到输入框中(一次一条)。
这里我们粘贴来自lncipedia(https://lncipedia.org/,lncRNA百科全书网站)的一条lncRNA序列PITPNM2-AS1:6进行预测。然后选择参数(一般默认)。最后点击提交按钮,等候几秒钟后会出现结果。
图4. NCBI ORFfinder序列提交及参数选择
2.3,结果查看
结果包括:
1, 预测的ORFs
2, 6种读码框(需要点击Six-frame translation处按钮才显示)
3, 每个预测的ORF所处的读码框、坐标及长度(核苷酸|氨基酸),可以下载查看具体核酸序列及氨基酸序列等
4, 对应的氨基酸序列,可以进行blast等操作
图5. NCBI ORFfinder结果
然而,相较于旧版ORFfinder(图5),新版NCBI ORFfinder的结果不好在论文中展示。苦寻无果后,我们参考文献中旧版ORFfinder的样式,开发了在线ORFfinder结果可视化功能。
图6. 旧版NCBI ORFfinder结果
3.ORFfinder在线可视化(仿旧版)
3.1,打开绘图页面
微生信-在线NCBI ORFfinder结果可视化 (bioinformatics.com.cn)
图7. ORFfinder可视化页面
3.2,拷贝示例数据
下载示例数据,该模块的输入为第一个sheet的内容。
(可以将第2个sheet的序列提交到NCBI ORFfinder,默认参数,获得sheet1的内容)。
图8. 输入数据示例
第一列为ORF的名字(label),第二列为链(Strand),第三列为读码框编号(Frame),第4、5列为ORF的起始和终止坐标,第6列为长度,包括核酸和蛋白的长度。
3.3,粘贴示例数据
必需输入包括两个:1,orffinder的结果,2,序列总长度(可由NCBI ORFfinder结果中查到)
图9. 必需输入
3.4,修改参数,并提交
图10. 颜色等参数
开放了图片尺寸,ORF颜色,最长ORF颜色等参数,以满足不同的绘图需求。
3.5,提交出图
结交约3秒后,在页面右侧出现结果预览图,其中最长ORF用紫红色标注。我们提供了4种图片格式供下载使用,两种矢量图(pdf,svg)和两种标量图(600 dpi tiff和300 dpi png)。
图11. 仿ORFfinder旧版可视化结果
注意:旧版中坐标小的在左侧,大的在右侧,跟新版略有不同。这里使用的左侧小,右侧大的排序方式。
没有预览就是没有出图,这时请参考示例数据,检查输入数据格式!
遇到文字截断,需要修改字体、调整字体大小等,使用inkscape软件进行操作。
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