注册博客的时候是想着每天记录一点，结果看看上一篇的时间，妈呀都整整过去一个月零十三天了！太懒了该打。废话少说赶紧写吧要不然一拖又一个多月了呵呵。。。

   从2月初进入实验室先认识实验仪器，因为是新实验室统统灭菌准备实验。然后等商家送药品过来之类的到3月初正式上手做实验。又因为是研一不时的还要上上课，拖拖拉拉一个构建质粒花掉一个多月的时间（而且只构成一个）。据说构建质粒是生物实验最基本的。

那就摆一摆我做的过程吧~~（大致过程如下）：

1处理引物    

   刚从生物公司拿过来的引物是粉末状的，加缓冲液（或者双蒸水）构成100uM的母液，再将其稀释10倍成为待用工作液（10uM）。取其5ul再加45uldd水（先加水再加引物）构成50ul体系于1.5mlEP管中。然后再加入模板（我们用的是Hela基因组DNA）和酶（我们用的是天恩公司的MIX酶）然后设置PCR程序，其延伸时间则根据目的片段的长度和酶的特异性来确定。

2 酶切（提前半小时准备制冰）

  20ul体系，酶（1ul）+DNA(5微升)+10*buffer(2ul)+12uldd水补齐至20 ul。水浴锅37度过夜。

3 连接（提前半小时准备制冰）

   用20微升体系（T4链接酶[1u]l+10*buffer[2ul]+d-pcr(1)[12ul]+d-pGl3[5ul]）  然后16摄氏度过夜。

4 转化（提前半小时打开水浴锅和制冰机）

   取感受态细胞一管（100ul）分装两管分别加链接液4ul（连接液应为感受态细胞的十分之一量）于两离心管中，冰浴30min，然后将其放入水浴锅内（42度小于一分钟）。再冰浴2-3分钟（全过程要轻拿轻放）。再加450ul无抗生素的LB（准备摇床  150转/min 45min）。在45分钟期间准备超净台（紫外照射15-20分钟）然后抽100ul准备涂板。涂板用含氨苄的固体LB，涂完后放放置37度烘箱过夜。

5 挑单克隆（提前30min打开制冰机，标号EP管）

   如挑出18个则配20份的量，最后加模板。

   模板（一个单克隆加10uldd水取1ul出来）+引物R和引物F各一微升+10ul 2*混合酶+7uldd水补齐至20微升。然后PCR一个半小时30个循环。

6 扩增质粒（打开摇床设置参数）

5mlLB +5ulAmpr+10ul菌液  37度250转/min过夜。

7.提取质粒（提前打开制冰机）

  1）取1.5ml培养物入微量离心管，12000转/min*2,弃上清，将离心管倒置，是液体尽可能流尽。

  2）往细菌沉淀中加溶液I，剧烈振荡，使菌体分散混匀。

  3）加溶液Ⅱ250ul，轻轻正反晃动6-8次，并将离心管放置在冰上2-3分钟。使细胞裂解。

  4）加150ul预冷的溶液Ⅲ，见白色絮状沉淀（可在冰上放置3-5min）

  5）加入450ul苯酚/氯仿/异戊醇,振荡摇匀，4度离心12分钟。

8酶切（提前打开制冰机水浴锅）

2  0ul体系，酶（1ul）+DNA(5微升)+10*buffer(2ul)+12uldd水补齐至20 ul。水浴锅37度过夜。

注：跑胶在酶切，质粒扩增，PCR 过程进行完毕之后均涉及。主要是检查或回收之类。

期间一些细微的注意事项没有写进去，可能在做的时候会自然而然的带进来。

具体的操作步骤其实每个试剂的说明书上都附带着有，原理，因为是一些很基本的操作，生物秀，生物在线，科学网上一搜一大把。但鉴于是自己是初次接触生物实验，以作纪念啦。