从不同细胞中分离提取高纯度、高质量的RNA对于很多分子生物学实验至关重要，如cDNA的合成、Northern印记分析、mRNA差别显示技术分离基因以及转录组测序等等实验，很大程度上取决于RNA的完整性。然而由于RNA自身结构的特点，以及周围环境中众多而又稳定存在的RNA酶，常常会使得RNA发生降解。在植物果实组织中，如玉米籽粒、柑橘、香蕉，含有丰富的多糖、蛋白，由于多糖与RNA在溶解性上高度一致，导致二者形成非常难溶的胶状复合物，使得RNA提取量下降，并造成一定程度上的降解；在植物老化组织中，如玉米老叶、冬青叶、茶叶，含有大量的多酚，当其氧化后，会使得RNA沉淀变成褐色，干扰了后续实验；有些产生次生代谢组织，如葡萄、苹果、甘蔗，其次生产物会降低RNA的获取率。

RNA提取原理：

目前在RNA提取上最常使用的是酸性酚—异硫氰酸胍—氯仿提取法，该方法首先由Ullrich于1977年提出。细胞在异硫氰酸胍的作用下发生裂解并释放出RNA，在酸性酚的作用下使RNA和DNA发生分离。当加入氯仿后，样品分为水相和有机相，RNA存在于水相中。收集水相后，加入异丙醇就可沉淀出RNA。因此无论DNA、RNA还是蛋白提取，其原理步骤大体相似，无非使细胞破碎，释放成分，通过溶剂分离回收。

RNA抽提试剂：

目前市面上有很多RNA抽提试剂盒，但对于某些特殊的组织，试剂盒并不是最好的选择。这里介绍一款抽提富含多糖、多酚组织RNA试剂配方。

富含多糖抽提试剂（简称抽提缓冲液）：0.25M  NaCl，0.05M  Tris-HCl（pH7.5），20mM  EDTA，1%（M/V）SDS（所有试剂均以DEPC水配制，121℃灭菌20分钟，冷却备用）。

富含多酚抽提试剂（简称抽提缓冲液）：0.25M  NaCl，0.05M  Tris-HCl（pH7.5），20mM  EDTA，4%（M/V）PVP（所有试剂均以DEPC水配制，121℃灭菌20分钟，冷却备用）。

常用试剂：氯仿：异戊醇（24:1）、异丙醇、0.1%（V/V）DEPC水（焦碳酸二乙酯，该化合物很香，但具有很强的致癌性，操作时一定要注意防护，过夜搅拌后，高温高压灭菌，灭菌后分解失去毒性，主要用于各种试剂配制时的母液）、75%酒精（以DEPC水配制）。

RNA抽提器材处理：

研钵、量筒、药匙等耐高温的器材以锡箔纸包好，在180℃烘箱中放置6个小时以上，冷却备用。枪头、EP管等塑料器皿以0.5M NaOH浸泡10分钟，然后用水清洗干净，高温高压灭菌，即可。

预防RNA酶污染注意事项：

操作时可在超净台上进行，常规的分子生物学实验室如果洁净度很高，在敞开的环境中操作也可以。戴上口罩，经常更换一次性手套，唾液或者汗液中经常带有RNA酶，会导致RNA降解。

操作步骤：

以玉米授粉后18天的籽粒为例。

1、研钵先以液氮预冷，倒入事先保存的玉米籽粒，迅速研磨，最好1分钟之内解决，并且要研磨充分，将研磨好的粉末加入1.5ml的EP管中；

2、向上述EP管中加入1ml抽提缓冲液，以涡旋振荡器剧烈震荡，使细胞充分裂解；

3、将匀浆后的样品置于室温5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离；

4、向EP管中加入0.2ml氯仿，盖好管盖，涡旋震荡20秒，室温放置3分钟；

5、4℃，12000rpm离心15分钟，此时EP管中样品分为两层，上层水相，下层有机相，RNA位于水相中；

6、吸取约600ul水相转移到一新的1.5mlEP管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀，至于-20℃冰箱中；（在吸取水相时，不要因为担心量不够，而过多吸取，会导致较多的DNA掺杂在RNA中）

7、取出EP管于4℃，12000rpm离心15分钟，离心后RNA以胶状形式沉淀在管底；

8、加入1ml 75%乙醇洗涤沉淀；（主要是去除异丙醇、SDS和EDTA等）

9、4℃，12000rpm离心3分钟，倒出乙醇，残余的少量液体短暂离心后，以枪头吸出；

10、室温放置晾干（使乙醇发挥干净，但不要使RNA晾的过干，会导致RNA很难溶解，大约2-3分钟即可），根据后续实验需要，加入50ul RNase-free ddH2O，利用移液枪反复吹打，混匀，充分溶解RNA。

11、实验前提前配制一块1.5%的琼脂糖胶，电泳槽和制胶槽最好进行无RNA酶处理。将得到的RNA母液稀释10倍后，取3ul，加入7ul上样缓冲液，点样，120V电压下电泳15分钟左右，拍照保存。

注：电泳后判断RNA质量的标准：有溴化乙锭存在时，电泳后28srRNA和18srRNA（s代表沉降系数）应当能清楚地在紫外灯下看到，同时还可以看到5.8srRNA和5srRNA，但二者由于比较接近，在较小胶浓度下，会叠加在一条带上。如果RNA没有被降解，28srRNA的亮度应当是18srRNA亮度的两倍，且这两条带都没有弥散现象。当以DNA酶消化后再次电泳时，加样孔附近如果仍有明亮的条带，表明DNA并未被消化干净。

12、电泳后，如果提取效果较好，以DNA酶进行消化处理，消化完成后，测量RNA的浓度。

注：RNA的贮存方法：①水溶解后的沉淀物贮存于-80℃，可保存一年以上，最为常用的方法；②RNA沉淀保存在75%乙醇中，4℃可放置一个星期以上或-20℃一年以上；③用去离子甲酰胺溶解RNA贮存于-20℃，可保存一年以上。（甲酰胺溶液提供稳定的化学环境，使RNA免遭RNase降解）

  以该方法提取富含多糖玉米籽粒RNA电泳图如下（本人所做）：

  以酸性酚—异硫氰酸胍—氯仿提取法提取RNA电泳图如下（Takara试剂盒说明书）：

   RNA提取过程中常见问题：

1、RNA吸光度说明：

   260nm、320nm、230nm、280nm下的吸光度分别代表了核酸、溶解液、盐浓度和蛋白质的吸光度值。OD260/OD280（R）体现了RNA中的蛋白质等有机物的污染程度，质量好的RNA的R值应在1.8-2.2之间，当R<1.8时，表明溶液中存在蛋白质等有机物的污染，当R>2.2时，说明RNA已经被水解成了单核苷酸。

2、RNA得率低：

①样品裂解不充分，细胞未能全部释放出RNA；②得到的RNA沉淀未完全溶解。

3、提取的RNA不溶解

   RNA在晾干时干燥时间过长，可在60℃溶解5分钟然后放置于冰上继续溶解几个小时，因此在RNA晾干时要把握好火候。

4、提取的RNA发生降解

  ①材料收获后没有及时保存，获取材料后迅速冷冻至于-80℃保存；②操作过程中引入RNA酶或者实验器材未能完全去除RNA酶。

   5、相关电泳图片分析

   下图可以看见点样空中有明亮的条带，表明存在DNA，未能消化干净，如果以这样质量的RNA来进行试验，会对后面结果产生极大干扰，出现假阳性。

       下图28s和18sRNA已挤作一团，进入同一条带，表明发生严重降解。

     如果碰到下面这样RNA电泳图是否表明所提取的RNA不能用呢？未必如此，可能是由于RNA的浓度过大，在电泳过程中在EB的拖动下，全部进入底部，此时可以通过稀释RNA母液，重新电泳验证。

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