实验背景：

血清血浆样本中含有大量的蛋白、脂类等物质，并且因来源的不同会存在较大的差异（粘稠度、颜色、PH值等），在外泌体提取过程中往往难以获得高纯度外泌体。

实验目的：

通过对血液样品（血清或者血浆）进行不同倍数的稀释后，提取外泌体，检测外泌体的纯度变化。

实验材料：

1，         血浆（选择原因：血浆成分较血清更为复杂，杂质物更多）

2，         血浆血清外泌体提取试剂盒（Umibio，UR52136）

样品预处理：

1，取样：从冰箱取出血浆样品后，于25℃水浴中进行解冻，将完全融化后的样品置于冰上；

2，样品初始用量：准备2.5mL 血浆样品；

3，离心去细胞碎片：将样品转移至离心管中，于4℃以3000 g 离心10 min，去除样品中的细胞碎片；

4，上清液转移：去除细胞碎片的离心上清液转移到新的离心管中；

5，离心去杂质：转移后的上清液于4℃以10000g 离心10 min，去除样品中杂质，将离心后的上清液转移至新的离心管中。

外泌体的提取：

1，      上清液预处理：在去除杂质的离心上清液中先加入预冷的1×PBS 进行稀释，再加入BloodPureExo Solution (BPS)；具体的加入剂量如下：

2，      溶液混合：加入BPS 试剂后将离心管盖紧，通过涡旋振荡器混匀1 min，再放置于4℃静置2 h； 

3，      沉淀外泌体：取出装有混合液的离心管于4℃以10,000 g 离心60 min，弃上清，沉淀中富含外泌体颗粒；（注：尽可能吸净上清液）

4，      外泌体重悬：取200 ul 1×PBS 均匀吹打离心沉淀物，待其溶解后，将重悬液转移至新的1.5 mL 离心管中；

5，      收获外泌体颗粒：将含有重悬液的1.5 mL离心管于4℃以12000 g 离心2 min，保留上清液，该上清液中富含外泌体颗粒。

外泌体的纯化：

1， 纯化外泌体：将收获的外泌体颗粒粗品转入Exosome Purification Filter（EPF 柱）上室中，于4℃以3000 g 离心10 min，离心后收集EPF柱管底的液体，此液体即为纯化后的外泌体颗粒；

2， 外泌体的保存：纯化后的外泌体以50-100μL 进行分装保存于-80℃低温冰箱中，以备后继实验使用。

外泌体检测

针对本次的外泌体测试样品，通过BCA和NTA的方法检测外泌体的总蛋白浓度、颗粒数量、颗粒分布，计算相对纯度（颗粒数量/蛋白量）。

相关方法学省略。

检测结果

1，      颗粒浓度检测结果：

2，      颗粒分布检测结果：

3，      蛋白浓度和相对纯度结果

结果分析

1，      本次实验中通过对血浆样品进行了不同倍数的PBS稀释，其中A组为4倍稀释，B组为6倍稀释，C组为10倍稀释，D组为20倍稀释；

2，      外泌体终产物随着样品稀释倍数的增加其蛋白总量随之降低；（A: 9.98mgàB: 7.36mgàC: 4.87mgàD: 3.83mg）

3，      通过计算单位质量对应的外泌体的颗粒数评价外泌体的纯度，随着稀释倍数的增加，外泌体的纯度也在增加；

（A：1.17E+09àB:1.20E+09àC:1.79E+09 àD:3.20E+09  Particles/mg）

实验结论：

     PBS稀释血浆样品后，可增加的血浆中的蛋白溶解度，因此在外泌体提取纯化过程中可以去除更多的杂蛋白。

通过PBS稀释血浆样品，可提高外泌体的纯度，随着稀释倍数的增加，外泌体纯度也随之提升，但是于此同时，外泌体的产量随之下降。

建     议：

1，      针对电镜、NTA的检测，需要高纯的外泌体，因此可以适当增加血样的稀释倍数，推荐10-20倍的PBS稀释；

2，      针对外泌体的蛋白、RNA相关的检测，推荐进行4-6倍的PBS稀释。