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1, 磨样:将冻好的菌丝加入液氮进行研磨,将研磨的样品加入1.5mL的离心管中(预冻)。
2, 裂解:向离心管中加入1 mL裂解buffer(20mM Tris-HCL, pH7.5, 20mM KCl, 2mM MgCl2, 25% Glycerol, 250 mM sucrose, 50 mM DTT)。裂解完后用一层microcloth过滤,除去cell debris,转移至新的1.5 mL离心管中。
3, 分离:第一步用1500gcf离心10分钟,四度,第二步用10000gcf离心10分钟,上清即为细胞质蛋白。
4, 第二步离心后的沉淀用1mL细胞核重悬buffer NRB1(20mM Tris-HCL, pH7.5,25mM MgCl2,25% glycerol, 0.2% Triton X-100)洗涤6-7次,每次15000gcf 10分钟,(洗涤过多会造成核蛋白损失,过少有细胞质蛋白的污染)。
5, 将沉淀用500 uL NRB2 (20mM Tris-HCL, pH7.5,10mM MgCl2, 250mM Sucrose 0.5% Triton X-100, 5mM B-巯基乙醇)重悬。
6, 在另一个新的离心管中加入500 uL NRB3 (20mM Tris-HCL, pH7.5, 1.7M Sucrose, 10 mM MgCl2, 0.5% Trioton X-100, 5 mM B-ME),将NRB2重悬液轻轻加至500 ul NRB3上, 4度,16000gcf,离心45 分钟。
7, 所得沉淀用400uL裂解buffer重悬,即为核蛋白。
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