结核分枝杆菌以及工业应用分枝杆菌在甾醇分解代谢的重要研究进展

                杨顺楷       四川  成都

1. 无奈的现实：顽症结核病及病原菌结核分枝杆菌

    

   结核病是一个全世界范围内的公共健康问题，是一个长期以来难于攻克的顽症特别是在发展中国家。它是经由结核分枝杆菌侵入人体的典型胞内感染菌，可以逃逸机体免疫系统的监视和清除，从而得以在宿主巨噬细胞环境中长期存活，甚至复制。一旦机体抵抗力下降，则人体患各种形式的结核病。据称全球范围内每年死于结核病人数达到200-300万，且已经出现多重的耐药菌株。于是探索其较为确切的分子机制正在持续不断地进行，以求寻找出合乎逻辑的靶点以发现新型高效的治疗结核病的药物。

    

2. 甾体激素药物原料生产的市场需求

    

   当今全球甾体激素原料药物生产的主要关键中间体：雄烯二酮（4AD）和雄二烯（ADD）二酮都是来自甾醇（主要是植物甾醇）微生物转化发酵生产的中间体，用来提供商业化生产糖皮质激素，盐皮质激素，避孕药，以及其他各种药用甾体化合物。到如今工业发酵降解甾醇侧链生产4AD和ADD最有效的菌种仍然是来自土壤放线菌的分支杆菌属（Mycobacterium）和红球菌属（Rhodococus）选育出来的菌株；目前4AD和ADD全球产品市场价值已经超过10亿美元。

    

   伴随着合成生物技术生产甾体激素中间体的研究进展，有必要将跨学科领域，即医学微生物的结核分枝杆菌，与工业微生物学及生物技术采用的分支杆菌（或红球菌）在甾醇分解代谢方面的共性基础研究知识予以介绍，以利于创新发展代谢工程在研制抗结核新药和国内近年投资千吨级产能，经由植物甾醇发酵生产4AD的高性能分支杆菌菌种改良及优化工艺调控选择方面具有重要性。

    

3. 对土壤放线菌相关微生物甾醇分解代谢细胞分子生物学研究新进展

    

   令人感兴趣的进展是放线菌目微生物（红球菌属和分枝杆菌属）对甾醇的氧化。已经知道利用放线菌对甾醇降解推断的代谢途径是基于鉴定中间体的方法提出来的，但是迄今为止对甾醇氧化涉及的所有酶并未鉴定出来。2007年荷兰Van der Geize 团队揭示了涉及红球菌和分枝杆菌有关菌株对编码甾醇分解代谢基因簇的优秀工作，提供了为何结核分枝杆菌能在巨噬细胞中长期存活原因的新视角，这就使得甾醇生物转化研究及工业应用具有重要进展的意义。

    

   这些工作来源于医学上对结核分枝杆菌以及其它放线菌病原体对胆固醇分解代谢的广泛研究，它对发现新靶点研制新药，以治疗结核病和其它肺部感染有重要价值;同时基于甾醇分解代谢基础上，开发出选择性切断甾醇侧链高产率工业发酵生产甾体中间体（4AD，ADD，9a-OH-AD）的新技术，促进了工业整细胞生物转化工艺生产甾体激素中间体的快速发展。

    

   现行研究鉴定的编码红球菌胆固醇分解代谢基因簇，经由生物信息学分析这些基因，在胆固醇上生长功能上调。加之，借助基因缺失和表征突变体手段，对胆固醇分解代谢中涉及的功能蛋白和外在的二酚双加氧酶的作用得以证实。甾体化合物如胆固醇，普遍存在于植物动物和一些微生物，特别是一些腐生菌的土壤放线菌能有效地利用亲脂性底物作为能源。鉴定的基因包括若干涉及甾醇摄入和侧链降解的基因。通常放线菌的甾醇降解含有3个主要的过程：甾醇摄入，C-17 位脂肪链的消除和甾体核的氧化。甾醇摄入体系经由11个基因启动子编码，上调对胆固醇和在谷甾醇等底物上生长的功能，提出胞外胆固醇氧化酶可能在甾醇转运进放线菌细胞中起作用。这些对细胞和酶工程研究是很有用的研究靶标。

    

   这些研究发现胆固醇的分解代谢在结核分枝杆菌及相关病原放线菌都是保守性的，显示出这类病原菌保留有代谢胆固醇的能力，以它作为碳源和能源，从而可以在其宿主的巨噬细胞环境中长期存活。可见甾体分解代谢途径是结核分枝杆菌在巨噬细胞中超能力存活的基础。

    

   生物信息学分析发现红球菌基因簇中的58个基因，包括能在胆固醇上生长的51个基因功能上调，同结核分枝杆菌基因组中的82个基因簇，以及其它放线菌病原体的80个基因簇，对其推定的启动子结构均是保守的。这些基因呈现了对胆固醇摄取，C-17分枝侧链的b-氧化，以及甾醇甾核分解代谢的特异性。种系分析表明红球菌中的4组甾体降解酶，与分枝杆菌涉及胆固醇分解代谢酶类是相似的。

    

   最近的基因组学分析发现，对于许多分枝杆菌工艺过程研究，包括结核分枝杆菌，红球菌是有用的实验研究模型。大约在结核分枝杆菌的3，999个基因中，其60%都是同红球菌基因保守的，还包括许多功能未知的部分。已经知道红球菌属和分枝杆菌属同属于放线菌目，前者的全基因组测序有9.7-Mb，它拥有多样性的酶系，构成了该属细菌分解代谢的多能性，特别是该属细菌能降解宽泛的有机化合物，尤其是亲脂性物质。从而引起药物，环境，化学和能源工业的极大关注。

    

【附录】

  结核病缘何再度肆虐全球？

杨顺楷     密西根州兰幸市一社区

近年来，由于结核病再度肆虐全球，据世界卫生组织（WHO）估计，每年因此病死亡人数达到200万人。其中印度中国，非洲等地域成为了重灾区。这一死亡率很高的传染病已经成为当代全球医药卫生领域的重大挑战之一。

结核病通常是经由名叫结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）细菌传染所致，是一种传染率及死亡率均高的流行病。目前的治疗方案为每月采用6-9种的多药治疗，问题的严重性在于已经出现药物耐受，即可能面临无药可治的局面。例如国内多年来抗生素的烂用，导致的耐药性，更加剧了对结核病治疗难度。因此须得寻求新的治疗结核病方法，以求降低用药量和缩短疗程，成为战胜这一危险疾病的当务之急。

结核分枝杆菌的致病特征与其他的病原微生物不同之处在于，即使侵入人体的其他病原微生物被杀灭，而结核分枝杆菌仍然可以躲藏于人体免疫细胞中存活下来。我们称这种免疫细胞叫巨噬细胞，它的寿命较长（数月以上），具有较强的吞噬功能，在机体免疫系统的感应阶段，它的作用是摄取-处理-传递抗原，以及调节免疫应答。然而，结核分枝杆菌被吞噬后，它能阻止吞噬体与溶酶体的融合而存活下来。这种结核病原体可以在人体内长期存活若干年，乃至数十年。

前文提到密西根州立大学（MSU）微生物及分子遗传系的Dr.Robert Abramovich 提出了一个新研究思路，即针对当今重新在全球泛滥每年死亡人数达200万人的结核病，经过他的基础研究可能导致一个全新的治疗方案，故获得了比尔.盖茨基金会的资助。他的研究内容包括表征结核分枝杆菌是怎样在巨噬细胞中存活下来的，然后在这些阶段结果的基础上开发新药。为了达到这些目标，要采用遗传学，基因组学以及生物化学手段挖掘新基因和蛋白质，以实现把结核分枝杆菌作为细胞内病原体的系统生物学研究。

在这些发现的基础上，然后转入高通量筛选平台的实验研究，以鉴定可干扰结核分枝杆菌生理适应的小分子化合物。对这种难于控制疾病的关键因素是要能够建立在人体内的慢性感染过程模式体系，从而导致发现的新药终止结核分枝杆菌在宿主体内的慢性感染。要建立结核分枝杆菌病原体慢性感染疾病模式，其基础的生理学要求仅只有在免疫细胞中生长时才被活化，故难于在体外（in vitro）复制靶标体系。

他们团队的研究策略局聚焦于结核分枝杆菌在天然存在条件下对氧敏感体系研究，即当其结核分枝杆菌在低环境氧时，试图采用莹光生物生物传感器建立一个持续的感染实验模型；借助这一试验体系拟筛选化合物数量250，000以上，以发现化合物靶向慢性结核菌感染，并有助于缩短疗程和/或解决多药抗性问题。这种莹光生物生物传感器可导致可视条件下的表征鉴定，这是一种新的非传统的结核病药物研发手段。

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