新月弯孢霉菌丝对甾体化合物羟基化活性研究

                               杨顺楷      四川    成都

说明：  此篇俄文译文资料也许对推动新月弯孢霉菌丝对甾体化合物羟基化活性研究有帮助，特别是在我国的重要基础皮质激素——氢化可的松生产中采用新月弯孢霉菌丝在磷酸缓冲液介质体系进行c11-beta羟基化反应提高转化率及氢化可的松收得率有帮助，以替代低效率的犁头霉菌“一锅煮”传统工艺。

摘要：研究表明新月弯孢霉菌丝体在对数生长期之末呈现对甾体底物（4-6g/L）最大11b-羟基化活性。借助在磷酸缓冲液中底物以微结晶颗粒（<20微米）悬浮液介质进行菌丝转化，较老龄化的真菌生长菌丝体具有升高14a-羟基活性的特点。这对于制备14a-羟基-雄烯二酮（14a-OH-AD）是必要的。但对于生物转化RS生产氢化可的松而言，则须得排除或降低14a-羟化副产物（14a-OH-RS）数量。为此考察了引入甾体底物到反应介质中的各种方式，研究菌丝不同的生长培养时段，转化甾体底物浓度，以及真菌抗重金属盐（0.35-0.50%）菌种无性系选育过程。结果得到对Co2+和Cu2+稳定的变异株，其真菌菌丝体表现有弱的羟基化活性或者完全无活性，与此同时观察到了黑色素生物合成含量升高的现象，其强度依赖于不良环境条件的程度。基于应用新月弯孢霉菌株研究甾体转化获得的结果，我们认为它是对外来化合物的解毒作用。

甾体羟基化反应，特别是C11b-羟基化在甾体生物技术中是最有意义的工艺过程，因为它涉及制造有效抗过敏抗炎甾体治疗剂。为了向孕甾烷系列引进C11b-羟基，优先采用半知菌纲的真菌新月弯孢霉（Curvularia lunata）进行研究。伴随着C11b-羟基化的主流生物转化，该菌菌丝体同时还有副反应发生，生成C11a-和C14a-羟基化产物，其强度取决于所采用选择的菌株，甾体底物的结构和转化反应的条件。迄今为止积累的研究资料，尚不足以实现较理想的生物羟基化反应，即对此问题尚不能得出一个包括新月弯孢霉在内，真菌羟基化究竟是怎样的生理作用的确切答案。细菌的9a-和26-羟基化反应（以及推断的C14a-羟基化）是解构甾体为CO2和H2O的中间阶段，且尚未发现直接依赖生长条件和转化间的相关性。借助真菌实现羟基化涉及的反应速度和方向，以及立体取向都依赖于微生物的种属特异性，转化底物类型，以及一系列物理化学因素。新月弯孢霉的C11b-羟基化起作用的影响因素有转化温度，溶解氧浓度，pH和培养基组成。虽然如此，但是在低等真菌的羟化酶确实含有某些重金属离子。对此，研究影响甾体羟基化主流转化及副产物产率之间的关系还是不够充分的。已经知道，改进新月弯孢霉羟基化产率在增加Fe2+离子浓度，而不是Cu2+的条件下，却积累副产物6b-和14a-羟基化甾体；而对于真菌短刺小克银汉霉（Cunnighamella blakesleeana）锌离子（Zn2+）确有助于改进羟基化过程。

本工作目标：利用新月弯孢霉生长菌丝研究对RS和AD的羟基化，向反应介质引入甾体底物的方式方法，以及重金属离子对新月弯孢霉甾体羟基化能力的影响，以便明确该菌培养物在这一反应过程的生理作用。

方法

——新月弯孢霉的培养及转化甾体的条件

该菌先前报道对雄甾烷和孕甾烷系列的羟基化甾体真菌菌株已经以冻干管形式保藏。为检验该真菌冻干材料甾体羟基化活性，移转到下列琼脂培养基，组成如下（g/L）:

酵母膏4.0，麦芽汁浸膏4.0，葡萄糖10.0，pH6.8-7.1.制得的斜面接种入含有如下组成的液体培养基：蔗糖30.0，酵母膏2.5，磷酸二氢铵3.0，氯化钾0.5，NaNO3 2.0，MgSO4 0.5，K2HPO4 1.0，pH6.0-.6.2 。然后在摇床（220rpm）28℃培养65-70h，以此培养物作为制备预订转化用的菌丝接种物，以10%（v/v）体积量转接，培养条件按照设定的24-56h培养收获菌丝，并称重；湿菌丝分批转入含有100ml磷酸缓冲液的锥形瓶（pH6.1）。转化甾体（RS或AD）以悬浮粒子（粒度15-20微米）形式混合进行甾体（RS或AD）生物转化。要么是与CaCL2复合物形式，要么是以DMF溶剂形式混合在28℃进行转化，摇瓶转速220 rpm。

____甾体底物的制备及转化产物分析

制备悬浮微粒结晶颗粒粒度不得大于20微米，以吐温-80 0.03%在蒸馏水中可得此粒度最小微粒结晶颗粒。RS同CaCI2复合物制备按照其试剂的1:1摩尔比混合。事先将RS溶于少量DMF，而二氯化钙溶于少量水，后二者混合之，出现的沉淀复合物过滤，于40-50℃干燥，称重。用甲醇处理制得的RS-CaCI2复合物,通常2.5g二氯化钙溶于25ml甲醇，向其中加入2.5gRS。转化产物分析采用硅胶薄层层析（TLC），展开剂系统RS底物为氯仿-丙酮（7:3）；AD底物为苯-丙酮（3：1）。

——选育对重金属盐稳定的新月弯孢霉菌株

利用上述琼脂培养基平板，在含有一定浓度的盐类（CoCI2，CUSO4，MoCI5，SnSO4）选择出稳定的株系，就可获得抗重金属离子的真菌菌株。在实施选择方案的每一阶段，注意采用盐浓度梯度逐步升高的方式。选择的第一阶段确定最低盐浓度抑制微生物生长效应，利用含有不同盐浓度的琼脂培养基平板进行选择。引入C.lunata的悬浮孢子，经过1日保温培养，逐日检审孢子萌发情况，包括时间，菌丝生长尺度等形态特征，直到较高含盐平板，再筛选一次为止。以达不到抑制水平而能够生长出无性系培养物的选择浓度水平，即在先前盐浓度培养基平板出现生长出的单一无性系培养物，对重金属敏感的大量真菌营养体死亡。但是对于获得稳定的真菌变异株而言，被认为是最大浓度起作用而获得抗性克隆，并不涉及初级阶段的抗性克隆。含有最高盐浓度的琼脂培养基用以保持高抗性的选择亚力，以便维持对重金属离子可稳定生长的真菌培养物。

结果和讨论

已经实现应用C.lunata 对孕甾系列甾体化合物的C11b-羟基化，即自RS生成主产物氢化可的松（化合物F），及副产物14a-OH-RS。而转化雄甾系列—AD, 生成主产物却是14a-OH-AD，且伴随发现微量副产物（推测是C11b-OH-AD，11b，14a-二羟基-睾丸酮。

据有关文献资料，C.lunata VKM F-644生长培养物发酵生长培养液pH可达到2.0-3.0，同时表明液体介质pH6.0-7.0呈现最佳的羟基化活性。该菌丝体在“饥锇培养”状态（缓冲液或生理盐溶液）的羟基化活性高于生长培养基液相（发酵液）。基于此，借助分离自C.lunata生长培养好的洗涤菌丝，并悬浮在磷酸缓冲液pH6.0-6.1的体系中，即100ml缓冲液含有湿菌丝10-12g（干重0.9-1.1g）的转化体系，对RS和AD进行生物转化研究。如用纯水保温培育会导致菌丝组织破坏，且反应体系pH上升到8.6，转化产物氢化可的松含量仅有25%；然而在磷酸缓冲液介质体系转化，产物氢化可的松含量高达68%（表1）。

表1. 新月弯孢霉菌丝转化RS生成氢化可的松依赖于底物引入反应介质的方法及数量

底物RS浓度    引入底物方法    转化40h后反应混合物中各甾体化合物的含量,%

  （g/L）                       RS         氢化可体松     14a-OH-RS

4.0*    微粒结晶，10-15微米  55            25              痕量

4.0     同  上              痕量           68               12

6.0     同  上               35            30               20

6.0**    同  上              20             55               15

4.0     CaCI2复合物          35            35              痕量

2.5    CaCI2复合物 +甲醇      5            62                10

4.0     DMF溶剂法            37           23               痕量

* 纯水介质温育

** 菌丝加倍

转化RS为氢化可的松的效率取决于把水不溶性底物引入反应介质体系的形式。引入RS微结晶颗粒度为10-15微米为宜，或者使用CaCI2-甲醇复合物引入法（介质含甲醇量不超过2%）均获得最佳结果，但是后者的RS底物浓度不超过2.5g/L。而合适的微结晶体系却可在底物浓度4 g/L，或更高的底物浓度下进行转化。以DMF溶剂(＜2%，v/v)引入甾体底物观察到了羟基化反应的低速率。此外，不论是转化底物类型（RS或AD），该生物转化过程都毫无例外地存在着伴生的甾体生物解构作用。

作者经文献调查与自己的研究资料分析，表明生成14a-羟基化产物的强度依赖于甾体底物的基本化学结构，菌丝生长培养程度，以及延长转化时间过程。应用C.lunata作为生物催化剂转化RS生产氢化可的松，该转化过程是比较低速率的，同时伴生副产物14a-OH-RS。但是利用新月弯孢霉VKM F-645菌丝转化环氧孕酮时，14a-羟基化始于11b-羟基化之后，生成11b，14a-二羟基化合物。利用洗涤菌丝羟基化RS生成14a-OH-RS的数量，静止期（49,56h）收获菌丝与对数期（24，32h）比较高达20%。比较老龄化菌丝呈现出升高14a-羟基化酶活性趋势，对AD亦然。当AD的底物浓度2g/L经由菌丝转化一昼夜，来自24h生长菌丝和40h生长菌丝生物转化积累的14a-OH-AD产物分别达到48%和65%的水平。

改变转化条件（底物加入量及引入方式，菌丝数量）不可能完全避免生成14a-OH副产物，当然也取决于选择的真菌菌株。例如当新月弯孢霉VKMF-644用于羟基化RS，在一定条件下测定出转化副产物14a-OH-RS可达到40%的水平。

提出了应用C.lunata作为出发菌株抗重金属盐的菌种选育方案。它有别于原菌株的一些生理生化特征而获得无性系变异株。将真菌C.lunata在含有0.2-2.0%钼钴铜盐浓度的琼脂平板培养，发现2%的钼盐浓度观察不到抑制真菌生长，而同时在Co2+和Cu2+分别在0.45和高于0.5%盐浓度的平板上却观察到抑制真菌生长的现象。并还对这种抗性Co2+和Cu2+的克隆菌株研究了它们的羟基化活性（表2）。

表2. 重金属离子存在C.lunata的生长情况   表3. 有铜盐和钴盐存在C.lunata菌丝羟基

                                            化RS情况

盐类名称    浓  度   琼脂板上                    反应混合物中的甾体百分率

            %      生长特征          介质中

CoCI2     0.20     密草坪状          盐浓度，% 化合物S 11b-OH物14a-OH-RS

0.35              稀薄草坪状        CuSO4，0.2  15.0     53.0    12.5    

0.40              有个别菌落        CuSO4，0.35 痕量     45.0    11.0

0.45                 不生长           CoCI2，0.30  13.0     42.0     7.5

CuSO4     0.20     密草坪状          对照组        7.0     66.0     16.0

0.35                    草坪状

0.45                    稀薄草坪状

0.50                    有个别菌落

  MoCI5     1.00      密草坪状

2.00                    密草坪状

SnSO4     0.50     有个别菌落

           1.00       不生长

生长20-24h的C.lunata菌丝（非抗性克隆）呈现特征性发颜色光现象；在老化的真菌培养物或是在饥锇条件下培养，以及存在对其生长属于毒性物质（有机溶剂，甾体底物）时，真菌菌株合成了黑色色素物质，经鉴定为黑色素（melanin）。

培养在琼脂平板上含有中毒剂量的重金属盐（0.4%CoCI2或0.45-0.50%CuSO4）的营养菌丝，移转接入不含钴和铜盐的液体生长培养基生长培养，有别于对照组（非抗性克隆株）在先前生长阶段存在的黑色素。真菌培养重金属抗性株积累的生物量与对照组之间并无显著差别，前者菌丝干重15-16g/L发酵液，对照18-19g/L。抗性菌株在最大重金属盐浓度下（Co2+，0.4%及，0.5% Cu2+）完全没有羟基化活性。在较低浓度Co2+和Cu2+条件下培养的活菌丝转化RS呈现的羟基化活性低于对照组；生成产物11b-OH-RS和副产物14a-OH—RS与对照组比较也同样如此。与C.lunata菌丝对RS的11b-羟基化不同，棕曲霉Asp .ochraceus）对孕酮的11a-羟基化过程，它对Cu2+是起作用的。

所以，已经有菌丝为防护金属离子毒性化合物影响不表现或者呈现低下的羟基化活力。先前已经发现新月弯孢霉在生物合成黑色素和羟基化活性之间的相互联系。对这种形成积累黑色素的关系，发现在升高温度（高于30℃）阻断黑色素生物合成过程的同时，也抑制了羟基化过程。并且，在诱导11b-羟基化酶的同时，也生物合成黑色素，其强度是在“饥锇”环境条件下进行的诱导过程，而并不是在（营养）生长培养基条件下发生这一过程。类似现象也在Rhizopus nigricans真菌11a-OH实验研究中观察到了，且11a-羟基化酶在磷酸缓冲液中诱导的强度较之蔗糖生长培养的发酵液高10倍。

相对而言，甾体微生物转化研究初期，立足于提出假说，实验研究偏重于微生物生理过程中带有“变戏法”的探究，推定实施的转化发酵为“几率”事件，即利用甾体物质作碳源。而生物转化的理论本质是对外生化合物的解毒反应。我们获得的数据资料对研究新月弯孢霉真菌对甾体化合物的羟基化，可看作是解毒反应过程，它具有基础研究的重要性。

本工作的完成获得俄罗斯重大研究基金的财政拨款支持。

译自俄文文献：2007,Prikl Biokhim Mikrobio,43(6):695-700