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黑色的道路该如何走？——出国留学读研小议
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“ 黑色的道路”该如何走？——出国留学读研小议
杨顺楷 四川 成都
每年的夏天都是出国留学读研的高峰期，以便赶上北美（美国和加拿大）各大学秋季开学的正学期。过去30年来，出国留学已经不再是稀罕之事，成为了国人培养提高子女教育素养，学习西方先进科技的重要手段。但是勿用讳言，近年出国留学呈现低龄化更加功利化的的趋势，已经大大不同于80-90年代公派出国的价值取向。当然。随着经济的全球化，我国的社会经济的快速发展，开放度，包容性和柔韧性更大，作为中青年学子留学读研选择的机会和余地更大。
出国留学读研，个人奋斗目标如果选定在经由硕士-博士-博士后的全过程科研工作教育训练，那麽须得把握住学术方向，通常说的“按着沟沟踩”就是这个意思。但是，要在这条“黑色的道路”走到目的地是要付出艰苦卓决的努力。在这里，我建议学子们最好是在国内有较好资质的科研院所先攻读一个硕士学位，设计出个人出国留学读研博士-博士后）打好出国 深造的学术框架，以利后来的发展。
在这里仅以本团队的一个成员出国留学读研——博士-博士后的经历，就很好说明了这是一条可行之路。近几年的博士-博士后科研工作教育训练，她已经在植物生物化学前沿交叉领域作出显著成绩，多次参加学术会议，阶断研究结果已发表在近期的美国国家科学院院报上，笔者特将该文部份译出附后（译文未经原作者审阅，文责自负），供有兴趣者参考
杨维力等6人，植物生物学系，生化分子生物及化学系，美国密西根州立大学东兰辛市.一新颖类型偏爱Sn-2甘油三磷酸酯酰基转移酶及其产生2-单酰基甘油磷酸酶活性
摘要 ：合成 膜酯和储备甘油脂质的首步是甘油-3-磷酸酯（G3p）的酰化。过去表征过的所有真核膜结合G3p酰基转移酶，都是酰化G3p的Sn-1位而产生溶血磷脂（1-酰化-LPA）酸。角质是带有w-氧化脂肪酸和甘油作为整合组份的甘油磷脂，作为胞外聚酯存在于所有植物的气生表面，提供一道对病原菌和抗胁迫的屏障，及维护器官的同一性。我们已经确定拟南芥里和角质生物合成相关的酰基转移酶GPAT4和GPAT6以转移酰化基团到G3P的sn-2位置为主。此外，这些酰基转移酶还具有磷酸化酶的结构域，因此能产生sn-2单酰甘油（2-MAG）作为主要产物，而不是以产生LPA为主。此前这种双功能活性未在任何生物体中见诸报道。此前这种双功能活性未在任何生物体中见诸报道。我们还对2-MAGs 作为角质合成中间体的可能性也进行了讨论。对于积累木栓质脂类单体必不可少的酰基转移酶类GPAT5，也呈现对G3P sn-2位置酰化的强烈偏爱。但是，GPAT5 不具有磷酸化酶的活性，其主要产物是2-酰化-LPA。显然，植物中的3-磷酸甘油酰基转移酶（GPAT） 可以催化更多的反应， 而不是仅仅局限于其sn-1 酰化反应的传统定义。无论如何，磷酸化酶是缺失的，且2-酰化-LPA是主要产物。GPAT4-6这类同源酶存在于所有陆生植物中，但是在动物，真菌或微生物（包括藻类）是不存在的。于是这些独特的酰基转移酶对于胞外甘油脂多聚物的（分子）进化和植物适应陆生环境具有重要性。这些结果为自然界中两种最大量存在的角质和木栓质的生物合成（分子）装配打开新视野。
www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.0914149107
(PNAS Early Edition)
引言
甘油-3-磷酸酯酰基转移酶（GPAT）（EC2.3.1.15）催化甘油酯类合成的初始步骤，由酰化辅酶A的一酰化基团倂入sn-甘油-3-磷酸（G3p）的sn-1位，生成1-酰化-溶血磷酯酸（1-酰化-LPA）。该反应已经在细菌，真菌，动物和植物广泛地表征。拟南芥中的8个植物GPAT酰基转移酶基因作为一个家族已经首次依据已知的非植物酶类序列相似性于以鉴定。当其在酵母中表达的时候，该家族的若干个成员表明催化酰基转移到G3p，尽管在甘油上的酰化位点尚未测定。
角质和木栓质是一道与细胞壁结合的亲脂性屏障。它们在调控小分子进出和作为保护屏障起作用方面均具有类似广泛的功能。角质和脂肪族类的木栓质两者的主要成分都是脂肪酸的w-氧化产物，称为w-羟基脂肪酸（w-OHFAs）和a，w-二羧酸（DCAs）,附带有不同数量的甘油。于是角质和木栓质也属甘油脂类。在自然界该类物质也是一种最大量存在的脂类聚合物，按表面积计算，其总面积5倍于地球陆地表面积。但是其特异性酶反应在角质的（分子）装配中多数仍属未知。我们最近报告了4种酶参与了拟南芥生物合成角质和木栓质，并调控角质或木栓质的数量和组成。我们的证据是根据突变体分析的结果，以及在转基因植物过表达获得的表型判据。拟南芥的叶和茎的角质含有大量的DCAs。GPAT4和GPAT8在叶和茎中呈现优势表达，且gpat4/gpat8基因双敲除突变体具有C18不饱和DCA角质单体显著降低的现象。GPAT5是有必要积累木栓质脂肪族化合物，特别是C22：0，C24:0w-OHFA和DCA单体。在拟南芥花中角质主要由C16单体组成，GPAT6在花中强表达，以及gpat6基因突变体在所有C16角质单体（DCA，16-羟基-和10，16-二羟基棕榈酸酯）都显著降低，同时GPAT6的过表达增高了这些单体量。加之，C16：0DCA在中链羟化酶CYP77A6失活时成为了主要的角质单体。
为了进一步表征由这些酰基转移酶，即GPAT4，GPAT5，GPAT6催化的反应，借助在酵母中GPAT-缺失突变体（gatI delta）和/或麦胚无细胞转移系统进行表达。使用a，w-二羧酸酰化-CoAs（DCA- CoAs）作为酰基供体和[14C]G3P作为酰化受体，对这些反应产物的分析表明，所有3种酰基转移酶酯化都偏爱酰化基团在G3P的sn-2位。加之，GPAT4和GPAT6均是双功能酶，它催化磷酸酶反应，生成sn-2单酰甘油（MAGs）代谢产物，但是GPAT5不起酶促反应。GPAT6的磷酸化酶活性借助推定的活性位点残基定点突变而完全失去活性，主要产物为2-酰化-LPA。这样，植物的GPATs呈现了一类反应的多样性，有别于以前报道的结果。本文就角质和脂肪族木栓质生物合成中GPATs的作用，讨论了这一新颖的酶学问题。
讨论
1. 角质和木栓质生物合成的黑箱. 虽然角质和木栓质是自然界最大量的脂类聚合物，但是对其详细的分子结构和生物合成步骤，即导致由其单体的装配聚合过程相对而言所知甚少。未知的内容包括在细胞内外分子装配程度，组成聚合物单体的数量，以及在单体和其它细胞壁结构间的交联程度。尽管最近鉴定了若干个在角质和木栓质生物合成中功能清础的蛋白质，但仍然缺乏细节内容知识，其中主要有P450s的CYP86和CYP77家族，GPATs，部分LACS和BAHD基因家族。于是若干蛋白质，包括ABC转运蛋白，HOTHEAD和BODYGUARD均都存在不确定的生物合成功能。有关这些多聚物的复杂性即便是拟南芥，都可能在单体组份上定义出几个新颖的角质和木栓质。在富含C16单体的角质GPAT6起了基础作用。这些角质以典型富含10，16-二羟基棕榈酸，并发现分布在拟南芥花瓣和萼片的表皮上为其特征。GPAT4和GPAT8对存在于叶和茎的角质富含不饱和C18脂肪酸和DCA的角质起了基础性且又是重叠的作用，并同时对气孔边缘构造起作用。最后，GPAT5要有C22:0和C24：0 w-OHFA和DCA作为木栓质单体贮备之用，例如在根部种皮的外皮均存在有这些物质。
在本研究中对GPAT4，GPAT5，GPAT6的体外表达及其产物进行了表征。但是都没有GPATs酰化转移sn-1位作为主要活性存在，令人惊奇的是该活性先前却已经在所有真核GPATs表征过的膜结合物检测出来。而这就是我们未曾预料到的结果，它表明上述每一个酰基转移酶偏爱转移酰化基团到G3p的sn-2位.同时也令人惊异地发现GPAT4和GPAT6乃是双功能G3P酰基转移酶/磷酸化酶，它俩的生物催化产生sn-2 MAG作为主要产物。这样，我们得出结论：角质甘油脂类生物合成经由不同的初始反应系列进行，有别于膜或贮藏甘油脂类的生物合成。该反应的亚细胞定位待定。我们的模式数据表明GPAT磷酸化酶和酰基转移酶功能域是经由膜螺旋表征相连接的，它可能是在两个催化结构域之间由60个氨基酸残基连结头联结，在膜的相互作用中起作用的。然而，要更好地了解该过程有必要作深入的分析。因此，留待要研究的问题是在表皮细胞中GPAT蛋白是否存在有更准确的定位，或许是一种ER（内质网）亚结构域同质膜结合。在这一方面GPAT8最接近同系物GPAT4，它已经被证明定位在胞液ER上的N端和C端。
1. sn-2 MAG 和GPATs在聚合物生物合成中可能的作用. GPAT4和GPAT6的事实真相可以直接在体外合成sn-2 MAG，这就提示sn-2 MAG可能就是拟南芥聚酯合成的元件。虽然对该情况作出了推测，但是阐明sn-2酰基转移和GPAT4和GPAT6双功能的本质可能提供角质合成又一个假说。例如，设想sn-2 MAG就是一个角质生物合成的中间体（或合成子）。可以设想DCA-MAG的游离羧基借助长链酰基-CoA合成酶进一步活化CoA。就此意义上，作为w-OHFA的一种类似物可以被识别，位于脂肪链的COOH之末端，而非另一末端，即脂肪链另一末端上的两个伯碳位OH基。它就可能让DCA-MAG-CoA进行转移第二个酰基到游离羟基上，造成在细胞内合成一个寡聚体。换言之，当MAG可以经由表皮细胞全部排出时，由于ABC转运蛋白WBC11已经提示在角质形成中起直接作用，MAG也可能被认为在角质合成中作为前体物排出的一种形式存在。无论如何，进一步的实验就是测试sn-2 MAG参与附加反应的能力，看来应有信息资料提供。
分析gpat5基因突变体种子木栓质单体时程曲线表明C22:0和C24:0极长链脂肪酸（VLCFA），w-OHFA和DCA单体的累积依赖于GPAT5。加之GPAT5异位表达，产生带有极长链脂肪酸的MAG作为外角质膜表层蜡的一组份。这些结果表明GPAT5的确是在体内作为一种VLCFA酰基转移酶甘油基受体起作用。这些研究具有特别的重要性在于胞外MAG在热动力学上作为优势的物质存在，且是较不稳定的sn-2异构体。于是我们现行的研究结果表明，体外的GPAT5偏爱转移酰基到G3P的sn-2位。这就与先前观察拟南芥GPAT5异位表达后体内产生的结果相吻合。体外的GPAT5酶检験产生出sn-2 LPA作为主要产物，而非是sn-2 MAG，它与酰基-CoA底物（FA/w-OHFA/DCA）无关。这样可在体内观察胞外生成的MAG经由表皮细胞转化LPA为MAG的内源性磷酸化酶/脂肪酶呈现活性的结果。换言之，我们尚不能排除当GPAT5同别的因子起作用时，)它可能参与磷酸化酶反应。
2. sn-2 G3P酰基转移酶/磷酸化酶对植物胞外脂类生物合成可能有特异性进化作用. 对GPAT家族8个成员的氨基酸序列分析发现，所有成员全都有一个plsC酰基转移酶C-末端区的结构域。但是，仅只有GPAT4，-6，-8，具有N末端区关键位点的所有保守氨基酸，它们对磷酸丝氨酸磷酸化酶的磷酸酶活性是致关重要的。借助搜索序列数据库可以检索出其它几个双功能酰基转移酶/磷酸化酶候选者。然而据我们所知，尚没有对这些推断的酰基转移酶/磷酸化酶于以表征或者证实其双功能活性。不过已经报道了一些含有磷酸化酶活性双功能酶的鉴定和表征的工作，例如有一种可溶性环氧水解（合）酶带有脂类磷酸酯磷酸酶活性。虽然已经观察到短杆菌（Brevibacterium）在体外甘油磷酸酯酰基转移酶体系生成sn-2 LPA，以及从菠菜叶增溶微粒体GPAT，尚未见有sn-2专一性的GPAT酶被克隆和表达。
根据化石纪录和其它证据，角质和木栓质的进化是结合当其海洋植物适应从水生到陆生迄今四亿年前期间所发生的遗转适应过程。该假说要得到支持，证据就是GPAT家族在脂类聚酯中生物合成中存在有植物特异性分子谱系，作为证据存在的事实是在动物或微生物（包括藻类）没有同源性鉴定结果能被检测>28%（Blast PE<10-5）。但是发现7个原生藓类植物（Physcomitrella patens）基因组和两个穗状地衣（Selaginella moellendorffii）类似物基因组作为非维管束陆生植物早期祖先却有如此（E<10-100）记录。这些同系物的大部分都具有如上所述的带有结合磷酸酶活性的保守残基。藻类不存在这类同源物，但是它们的存在对大部分广泛分佈的原生陆生植物却支持了一种假说，即双功能GPATs对陆生胞外脂类结构生物合成可能存在专一性分子进化现象。作出的一个类似结论基于发生在P.patens和较高等植物CYP86家族脂肪酸的w-氧化酶，但不是在藻类或其它有机体。
近年虽然在角质和木栓质单体生物合成知识方面已取得很大进展，但是在了解它是怎样进行分子装配，成为植物细胞质膜外一种不溶性胞外聚合物基质，对该植物生物化学仍然留下一个挑战性课题。本研究不涵盖发现一种未预料到的双功能酶过程，或许该过程是导致合成聚合物的早期步骤。进一步开拓sn-2 MAG是如何参与细胞内外反应，探讨酰基转移反应，从而导致生成植物甘油酯类聚合物方面应该打开一个重要的视野。
—— 部 分摘译自：Weili Yang,Mike Pollard , John Ohlrogge et al. A ditenct type of glycerol-3-phosphate acyltransferase with sn-2 proference and phosphatase activity producing 2-monoacylglycerol,, www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.0914149107
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