偶发分枝杆菌发酵断甾醇侧链积累9a-羟基雄烯二酮

                杨顺楷    四川   成都

摘要： 利用偶发分枝杆菌（Mycobactirium fortuitum）CICC 10279发酵断甾醇侧链进行了定向菌株筛选。对选择出的具有较高甾醇降解活性菌株，借助TLC法开展多批次生物降解实验过程研究。并重点对积累9a-OH-AD化合物的菌株稳定性进行考察。在此基础上利用选择出No.22菌株开展经由摇瓶Ⅱ级培养分别转化底物胆固醇及植物甾醇半微量制备实验。所得样品经用TLC，HPLC，MS，1HNMR，13CNMR，i.r.等光谱数据分析确证其结构为9a-OH-AD。半微量制备实验以胆固醇和植物甾醇为底物9a-OH-AD重量收得率分别可达34.0%及30.8%。这就可能为高效含鹵（氟，氯）皮质激素药物工业生产提供一种很有潜力的中间体。

关键词：发酵断甾醇侧链；定向筛选；偶发分枝杆菌；9a-羟基-AD；半微量制备实验

Primary studies on the sterol sidechain cleaved in a fermentation to 9a-hydroxy-androst-4-ene-3,17-dione(9a-OH-AD) by a strain of actinomycete Mycobactirium fortuitum

YANG Ya-li,YANG Shun-Kai

(Chengdu Institute of Biology,Chinese Academy of Sciences, Chengdu 610041,China)

Abstract: A set of directional Screening strains for the sterol sidechain cleaved in a fermentation into 9a-hydroxy—androst-4-ene -3,17-dione(9a-OH-AD) was developed with a strain collected actinomycete Mycobactirium fortuitum CICC 10279.For selection of these strains having high-biodegradation activity，we conducted their investigations of experimental biodedratation processes with TLC procedure.Our focus of study on the strain stability for production of 9a-OH-AD compounds accumulated in a culture broth,and based on these results,some of Preparative-scale production of 9a-OH-AD experiments with semimicro- amount(e.g.,several decade of mg) level using growing culture were able to be respectively converted the substrate cholesterol and phytosterol to metabolites by using lager second-stage culture shake flasks with the strain selected NO.22 from M.fortuitun,and the crystal product contained,according to HPLC ,95.7% of 9a-OH-AD ,and 3.7 AD was combined,and its spectroscopic data(TLC，HPLC，MS，1HNMR，13CNMR，i.r.,et al)were used to elucidate the structure of  9a-OH-AD.The yield of 9a-OH-AD based on transformed cholesterol and phytosterol was respectively 34.0% and 30.8.Thus,the 9a-OH-AD of steroids could lead to intermediate compounds useful in the pharmaceutical industry,namely as starting materials for the production of 9a-Halogen(e.g.,F and CI)corticoids.

Key words: cleavage of sterol sidechain with fermentation;direction screening; Mycobactirium fortuitum CICC 10279; 9a-OH-AD;Preparative-scale experiment on a semimicro-amount

国内少有报道微生物发酵断甾醇侧链制备9a-羟基雄烯二酮（9-OH-AD）的实验研究，而近年国外已经形成生物制造9-OH-AD研发热点[1,4-7]。该甾体化合物因其化学结构上9a-羟基的存在，可借助已有的常规化学手段形成C_9,11-双键体系，从而很方便地在C₉-位引入一个卤素原子，以及在C₁₁b-位形成糖皮质激素必不可缺少的功能羟基，因此9-OH-AD用于合成数种高效含鹵（氟，氯）糖皮质激素，即地塞米松，倍他米松，糠酸莫米松，及氯地米松等更具有吸引力[2]。

已经知道,微生物发酵降解甾醇（动植物源）断侧链，产生C-17 酮甾体化合物，即AD，ADD，及9-OH-AD是一个复杂的微生物多酶体系分解代谢过程，代谢调控多样，菌株种属亲株和突变株差异有别[3-7]。近年，国内某公司借助从欧洲国家引进耻垢杆菌（Mycobacteriun smegmatis）发酵转化甾醇已经实现工业化生产AD，据称产量达到年产百吨级[8]。新近国内李维等也首次集中报道了借助定向富集培养技术，从成都动物园食肉动物云豹（Neofelis nebulosa）的新鲜粪便样品分离筛选出放线菌戈登氏菌株（Gordonia neofelifaecis）NRRLB-59395，能选择性发酵降解胆固醇侧链，积累优势的C-17酮甾体代谢产物ADD（转化率87.2%）；并还对该菌株的基因组草图序列和其断胆固醇侧链的新型放线菌分类类群进行研究。显然这一阶段研究结果具有应用基础研究的重要性，有应用于工业开发生产ADD的巨大潜力[9-11]。

本文报告利用具有产9a-羟基雄烯二酮（9a-OH-AD）能力的偶发分枝杆菌（Mycobacteriun fortuitum ）CICC 10279 发酵断甾醇侧链的定向菌株摇瓶筛选及半微量制备9-OH-AD初步实验研究结果。

 1 材料与方法

 1.1 供试菌种

     偶发分枝杆菌（Mycobacteriun fortuitum ）CICC 10279购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（隶属单位：北京中国食品发酵工业研究院），该菌株来自ATCC 35855 。选择出的菌株保存在中国科学院成都生物研究所生物催化与分子进化实验室。

  1.2 主要培养基

     菌种保藏培养基：营养肉汁琼脂

     Ⅰ级种子培养基（g/L）:葡萄糖5g，蛋白胨8g，酵母膏5g，MgSO4-7H₂O 0.5g

     Na₂HPO4 4.5g,KH₂PO4 3.4g, 自来水 1000ml，调整 pH7.0

     Ⅱ级转化培养基（g/L）:葡萄糖4g,甘油20g（16ml），蛋白胨10g，酵母膏5g，（NH₄）2SO4 1g，，MgSO4-7H₂O 1g，Na₂HPO4 2g,KH₂PO4 3g,FeSO4  0.01g，底物添加量（0.03%，w/v），自来水 1000ml，调整 pH7.0

   1.3 化学药品及试剂

      胆固醇（99%）由上海第六制药厂，植物甾醇（≧95%，平均分子量406.48）由西安瑞源生物科技有限公司和保定加合生物化学有限公司惠赠，均都作为底物试剂用；雄甾-4-烯-3,17-二酮（AD）和雄甾-1，4-二烯-3,17-二酮（ADD）（99%）购自前西德舒华（SERVA）生化药品公司作标准物质分析用；吐温-80也用于改进甾体底物溶解度，其它的化学品及溶剂均是分析纯及从商业途径购买。

  1.4 培养及生物转化方法

      将购自中国工业微生物菌种保藏管理中心的偶发分枝杆菌（M. fortuitum ）CICC 10279 菌株经摇瓶2-3d活化培养，用稀释法涂平板，30℃保温培养，在2-3d期间随机挑取菌落移植到斜面培养，共计分离纯培养物斜面250只备用。

      菌株筛选操作步骤如下：借助Ⅱ级液体发酵培养方法，250ml锥形瓶装量25ml或50ml液体培养基，30℃，180 rpm，旋转式摇床Ⅰ级培养1-2d后，按照5-10%（v/v）液体培养物转接Ⅱ级培养18-20h，即对数生长期之末添加底物0.1%（w/v）或按设计要求添加底物制剂。

甾醇底物储备液配制法：1)1.25g 底物加50ml乙醇，和0.8ml吐温-80混合研磨成均匀的混悬液；2）b-环糊精11.35g，227ml水，植物甾醇4.07g溶于丙酮后加入混合，搅拌12h，超声波处理30min，得b-环糊精-植物甾醇包结物14.02g；类似处理3.87g胆固醇，得b-环糊精-胆固醇包结物13.42g；3）吐温-80 10g，胆固醇或植物甾醇10g，加水100ml，混匀置于121℃处理1h；再置于超声波处理30min，制得较为均一的乳化储备液（甾醇浓度为100mg/ml)制剂备用。添加底物后开始进行生物转化。每间隔1d取样，TLC法监测转化过程。筛选试验设定2组平行对照，即接种生长培养不添加底物/空白培养基添加底物。

   1.5 转化产物的分离及纯化

       发酵转化终止，液体反应混合物加热至沸腾10min，凉到室温，用等体积乙酸乙酯提取（v/v）。有机相合并，无水硫酸钠干燥，减压旋转蒸发到球瓶仅有残留物为止。残留物溶解于醋酸乙酯，1）硅胶柱层析：冲洗剂石油醚（60-90℃沸程）：乙酸乙酯（6:4），流速1-2ml/min，分部搜集5ml/管，合并含相同甾体的溶剂，旋转蒸发，最后每一个分离开的甾体物质作结晶或油状物干燥处理；2）制备型TLC：展开剂为石油醚：乙酸乙酯（6:4），刮取含甾体产物或底物条带硅胶粉末，干燥；用氯仿：甲醇（1:9）热回流溶出，过滤，旋蒸浓缩，得晶形物。

   1.6 分析方法

      TLC使用青岛海洋化工厂出品的薄层层析硅胶GF254（60型），铺制方法及层析板有多种类型尺度，包括供菌种筛选用的20X20cm的大板（含3mm厚度的制备层析板），条板，以及监测转化过程，即转化产物追踪的显微镜载玻片小层析板等[12]。TLC选择如下的溶剂系统：A.石油醚-乙酸乙酯（6:4）；B. 石油醚-丙酮（6.5:3.5）；C.苯-乙酸乙酯（8:2）。对于甾醇降解所产生的代谢产物9a-OH-AD ，AD，ADD，及底物（胆固醇或植物甾醇）的RF值如下：A，9a-OH-AD =0.17，AD=0.46，ADD=0.34，底物=0.7-0.8；B. 9a-OH-AD =0.20，AD=0.56，ADD=0.48, 底物=0.64;C. 9a-OH-AD =0.18， AD=0.44, ADD=0.31, 底物=0.62(拖尾)。硅胶板用前置于105℃活化1h，点样展开后，首先TLC板在254 nm UV灯下借助荧光猝灭观察可能的甾体代谢产物（AD，ADD，及疑似9a-OH-AD）；底物喷雾稀硫酸-甲醇显色，可在接近前沿显紫红色。

      HPLC分析在Schmadzu LC色谱仪上按照如下条件进行：反向C18柱（4.6x250mm,GL Scionces,Japan）,流动相，正己烷-异丙醇（85:15）；流速，1ml/min;柱温，35℃；观察到的保留时间：AD，7.443min；ADD，10.708min；9a-OH-AD样品，13.138min。

        熔点（mp）测定在梯尔（Thiele）氏熔点测定仪进行，温度计未经校正。相关谱学数据均在本所Perkin-Elmer FTIR红外光谱仪，Finnigan LCQDECA 质谱仪，Bruker AV-600核磁共振仪（1H和13C均以CDCL3为溶剂TMS为内标）测试。

   2  结果与讨论

   2.1 偶发分枝杆菌CICC 10279发酵断甾醇侧链定向筛选及选择

          参照Patrick J.Davis有关哺乳类药物代谢微生物模式可行的定向筛选方法[13，14]，对经由购自中国工业微生物菌种保藏管理中心的偶发分枝杆菌（M. fortuitum）CICC 10279（←ATCC 35855）作为出发菌株，经纯度鉴别，活化培养，稀释平板分离，随机挑取斜面菌种250只，按照每批20-30只250ml锥形瓶装量25ml液体培养基进行Ⅱ级发酵筛选。分别在2d-11d摇转期间取样，利用TLC法对上述菌株经过8轮初筛。结果发现26株菌有能力降解胆固醇，在不同的转化时程积累起甾体代谢产物（疑似）9a-OH-AD和/或AD[表1];再经2轮复筛选择出降解胆固醇能力最强，且积累目标产物9a-OH-AD浓度较高而稳定的偶发分枝杆菌（M. fortuitum） 菌株 无1-1-11，1-2-10，无1-1-9，无1-1-15，共计4株菌；最后再经淘汰筛选，选出No.22号菌株作为半微量生物转化制备合成实验用菌株。

      表1. 偶发分枝杆菌CICC 10279转化胆固醇定向筛选实验结果

      Table 1 The results of direction screening for conversion of cholesterol into 9a-hydroxyandrostenedione with Mycobactirium fortuitum CICC 10279

* 符号说明：据TLC点标样评估荧光猝灭观察甾体代谢产物色斑大小及深浅程度（AD（D），及疑似9a-OH-AD）分为：+，10-30ug/ml;++,50-100 ug/ml;+++,≧200-300 ug/ml;同理底物消减程度由TLC板层相应位置喷雾稀硫酸-甲醇显色剂在接近前沿显紫红色斑点予以判断高中低底物剩余量，0，表示底物消失。

   2.2 甾醇生物转化过程目标产物9a-OH-AD的搜寻鉴别

          鉴于未能搜集到9a-OH-AD标样，在仅有AD和ADD标样时，TLC检测分析中，可根据其产物AD在引入9a-羟基后，形成较为稳定的甾体代谢产物9a-OH-AD ，且分子极性增大，出现Rf值显著低于AD和ADD标样的色谱斑点（Rf值=0.17-0.20）作为疑似9a-OH-AD；再经制备TLC，刮取疑似产物色谱带硅胶粉末，甲醇淘析，旋蒸干燥，样品利用上述3组TLC展开剂系统点样分析，Rf值分别为A=0.17；B）=0.20；C）=0.18；且均为单一色谱斑点，可排除是AD和ADD的可能性，因为与标样AD（D）的Rf值同板展开比较，其Rf值低得多。样品再进行质谱分析，表明有其分子离子峰[M]=302.41及主要碎片峰存在；同时与 AD标样作质谱分析，仅有其[M]=286.60的分子离子峰及主要碎片峰出现。且该结果可多次重现，因此可判定该疑似甾体代谢产物就正是9a-OH-AD。加之，出发菌株（M. fortuitum）CICC 10279（←ATCC 35855）本身已报道有产9a-羟基雄（甾）烯二酮的能力[14],因此对偶发分枝杆菌CICC 10279定向筛选意义就在于此。

2.3 甾醇侧链选择性降解过程分析

        综合评估过去40多年来国内外有关微生物甾醇侧链降解代谢过程文献资料，其机理与脂肪酸b-氧化途径相似[图1]。胆固醇侧链降解起动于C27羟基化，再氧化为C27羧酸，继后b-氧化失去丙酸乙酸，最后再失去丙酸，形成C17酮甾体化合物[4]。已有报道偶发分枝杆菌（M. fortuitum）ATCC6842野生型菌株转化b-谷甾醇，则彻底降解为CO₂和H₂O[15]。

该菌株经由诱变技术获得的偶发分枝杆菌突变株（Mycobacteriun fortuitum ）CICC 10279，在我们设计的定向筛选程序中，在以胆固醇和/或植物甾醇作为底物，经由该菌发酵断侧链生成目标代谢产物9a-OH-AD是可行的，表明它在发酵液中确实具有选择性降解甾醇侧链积累9a-OH-AD的能力。在整个实验研究过程中，我们得到如下结果：

(1)属于放线菌的偶发分支杆菌（M. fortuitum）CICC 10279在自然定向选择过程中，菌株转化能力及水平存在着较大的差异。经活化平板分离纯培养物进入初筛菌株淘汰率达89.6%，即近9成菌株对甾醇无转化能力或个别菌株（3-1-1，表1未列出）在2d转化期间将胆固醇彻底耗尽，TLC检测不出底物和甾体产物，即底物被去结构化。再经复筛Ⅰ保留6株, 复筛Ⅱ选出3株，最后选择出1株22#（1-2-10）斜面菌株用于制备实验。

（2）在设计的数种生物转化实施方案中，在以胆固醇和/或植物甾醇作为图1. 图式胆固醇和植物甾醇经由细菌发酵断侧链生成AD(D)及9α-OH-AD

Scheme 1 Selective biodegration of substrates both of cholesterol and /or phytosterol for production of androst-4-ene-3，17-dione（AD），androsta-1，4-en,diene-3，17-dione（ADD），and 9a-hydroxy- androst-4-ene-3，17-dione（9α-OH-AD） with Mycobacterium fortutium

底物的发酵降解过程中，初筛获得的26株菌呈现对甾醇差异较大的转化能力。通常能选择性断侧链生成C-17甾体产物（AD（D），和9a-OH-AD），但是它们对胆固醇降解代谢较快于植物甾醇，前者形成的甾体产物较易被去结构化，具有快速代谢特点，即最终被氧化为二氧化碳和水。如图1所示，一旦甾醇降解到AD，如果A环C1,2-位脱氢酶和9a-羟化酶同时起作用，则甾环的去结构化不可避免。通常认为甾体9a-羟基化在先，究竟始于AD还是启动于带有部分断脂肪链的甾体中间体的9a-羟基化，仍是一个不确定性问题。

（3）借助TLC检测分析，对初筛获得的26株菌较系统地进行甾醇断侧链，积累C17-酮甾体化合物能力考察。重点关注底物浓度降低，形成的AD（D），及9a-OH-AD产物浓度水平和稳定性进行了2-11d期间的离线取样动态时程评估（表1）。发现部分菌株具有选择性生物降解断侧链，积累目标产物9a-OH-AD的能力，在一定的条件下可一过性观察到AD（D）的代谢产物出现。如初筛中的菌株3-4-3，3-5-3，无1-1-3以及1-2-7即如此。但是能持续积累较高浓度且色谱斑点呈现缓慢变浅的较低Rf值的化合物，就正是目标产物9a-OH-AD。合理的解释是：当其反应体系中积累AD占优势，且C9-羟化酶活性高，A环C1,2-位脱氢酶活性较弱，反应平衡则可顺利地朝向生成9a-OH-AD移动；如果C1,2-位脱氢酶活性升高，引入双键后的产物9a-OH-ADD很不稳定，被快速去结构化，最终被代谢为CO₂和H₂O。

   2.4 确定优势积累9a-OH-AD的条件

      基于初筛和两轮复筛工作基础上，建立起发酵甾醇选择性断侧链产生9a-OH-AD的条件。主要内容如下：

（1）菌种及Ⅱ级发酵转化：发酵培养物对底物有较高的转化率，且优势积累目标产物9a-OH-AD，能在转化反应体系存留较长时间不被代谢降解是基本前提条件。复筛Ⅰ保留6株菌进入复筛Ⅱ，结果选出3株再进行筛选。经反复评估，最终选择出NO.22菌株用于半微量制备实验备用菌株。该菌株对甾醇转化过程积累9a-OH-AD产物时程如下：1d取样TLC分析，开始积累目标产物，色斑明显，底物浓度高；2d，产物浓度升高；3d，产物浓度进一步升高，底物尚存留一半；4d，产物浓度继续升高，底物浓度显著降低；5d，产物浓度继续维持在高水平，底物耗尽；6d，产物浓度降低；9d，取样TLC分析，产物浓度为零，即甾体产物被彻底去结构化。

（2）底物添加方式：鉴于甾醇在微生物液体发酵培养物生理水相中的溶解度低于2mg/L，因此改进其亲脂性底物在生理水相中的溶解度很有必要。我们选择出的甾醇乳化，b-环糊精包结物，以及乙醇溶解底物的添加方式都是可行的，转化效果以前二者为佳。有报道称甾醇降解产物AD在水中的溶解度为50mg/L[17]。可以推断9a-OH-AD由于羟基的引入，产物分子的亲水性有所提高。因此选择合适底物添加方式，监测转化过程，认真评估底物/产物浓度的消涨关系，适时终止转化反应进入产物回收阶段对提高产率是必要的。

（3）分次补加底物：为降低生物发酵转化过程中的底物和/或产物抑制，借助TLC监测，在合适转化起始底物浓度基础上，选择合适时段分次补加底物继续发酵转化是有用的。例如，利用NO.22菌株在摇瓶的半微量制备试验中，起始底物浓度添加含有100mg植物甾醇乳化储备液，转化1d后再次补加底物100mg植物甾醇继续转化，到第3d（72h）终止转化反应进入产物回收，最终获得产物重量收率30.8%的较好结果。

   2.5 半微量制备实验及其产物结构确证的光谱数据

          借助对NO.22菌株的Ⅱ级发酵转化甾醇，在摇瓶试验基础上进行了半微量制备实验（表2）。

      表2.偶发分支杆菌（M. fortuitum）NO.22菌株发酵转化甾醇制9a-OH-AD半微量制备实验结果

      Table 2 The results of Preparative-scale production of 9a-hydroxy- androst-4-ene-3，17-dione（9α-OH-AD ）from sterols with Mycobacterium fortutium

     Note,Batch 1,2,and 4=cholesterol;3 and 5=phytosterols as substrate

           表2的结果说明，选择的NO.22菌株发酵降解甾醇侧链制9a-OH-AD是可行的。对胆固醇和植物甾醇作底物在不同的转化条件下分别都可以制得目标产物。但是鉴于前者作为动物甾醇资源有限及商业开发成本问题[1],看来植物甾醇是工业开发较优大宗原料来源；底物添加方式以乳化剂，b-环糊精包结物，以及与水混溶的有机溶剂的微粒结晶形式均可。但是从5批制备实验结果分析，转化时间从1d到8d，存在较大变动幅度范围，这就提示在液体转化反应混合物中合理调控底物/产物浓度消涨关系的重要性。转化时间较长，说明该菌株具有较弱的D1,2-位脱氢酶活性，有利于积累目标产物9a-OH-AD;如果液体培养物D1,2-位脱氢酶活性升高，则易导致甾环的去结构化[1]。

           对上述半微量制备实验所得产物，经如前述硅胶柱层析分离，样品再经丙酮精制，得白色粉末结晶。我们应用包括TLC，HPLC，1HMR，13CNMR，i.r.,and MS 对样品进行结构确证分析，其数据如下：实验值：mp 198-202,文献值：mp 218-220（EtoAc）[5]；i.r.Vmax（cm-1） 3453 2929 1738 1651；ESI-MS m/z 301[M-1],325[M+Na],341[M+K]；1HMR（CDCI3）d（ppm）0.92（3H,s,H-18）1.35(3H,s,H-19)，2.42[OH,m],5.89[H,d,H-4]; 13C NMR(CDCI3)d:28.6(C1),34.0(C2),198.6(C3),127.3(C4),167.5(C5),31.5(C6),24,3(C7),37.2(C8),76.7(C9),44.6(C10),26.3(C11),27.1(C12),47.2(C13),44.4(C14)21.6(C15),35.7(C16),219.7(C17),12.7(C18),19.9(C19)。 样品在前述的3组TLC二元溶剂系统展开，Rf值分别为0.17,0.20，,及0.20，与AD，ADD标样比较，Rf值有显著差别，可定性判定是目标产物；加之，该样品的HPLC分析结果说明其保留时间（tr）13.138min，同AD的7.443min，ADD的10.708min显著不同（但是该样品纯度按照峰高计9a-OH-AD占95.7%，尚含有AD3.6%，其它杂质0.6%）。这些数据分析资料证实了所得样品化学结构就是目标产物9a-OH-AD。

3.小结

应用偶发分枝杆菌（Mycobactirium fortuitum）CICC 10279发酵断甾醇侧链生产9a-OH-AD是可行的生物制造技术途径。由于该微生物属于放线菌类，菌种的定向筛选应能满足其生物学特征，因此在文献调查基础上设计合适的液体培养基是必要的，以提供菌株纯培养物细胞生长阶段及作为生物催化剂对甾醇发酵转化两阶段之需要。借助灵敏可靠的检测分析手段，搜寻出菌株细胞代谢（生物转化的同义语）甾醇—从降解侧链到积累目标产物9a-OH-AD的过程特征，即生成AD是必要的9a-羟基化中间体，同时在液体转化反应混合物中，能维持较长时间9a-OH-AD产物浓度不降低，则可避免因A环C1,2-脱氢中间体9a-OH-ADD的不稳定性导致的去结构化。利用选择的NO.22菌株在摇瓶Ⅱ级发酵降解甾醇侧链的半微量制备实验是必不可少的方法学，表明本工作具有工业生产9a-OH-AD的潜力。

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附件1：遵嘱增补的色谱图及光谱分析图，供编辑部用

图    产物9-OH-AD的红外图谱

Fig      IR spectra of the 9-OH-AD producted

图   产物9-OH-AD及中间体AD的HPLC图谱

Fig.  HPLC chromatography of the 9-OH-AD producted

附件2

本文发表在《应用与环境生物学报》，2015,21（2）：256-262；引起国内外读者重视，现在转发本网，提供有兴趣读者参考。