如果cassette exon本身有stop codon的三碱基序列，splicing过程中它本身发生inclusion，即最后的mRNA里包含这个cassette exon。而且巧合的是，在最后mRNA的整个ORF里，cassette exon的stop codon序列确实行使stop codon功能，那可想而知，整个mRNA在翻译蛋白时，翻译过程将提前在这个意外stop codon里停下来，进而整个mRNA、整个蛋白质的完整性就被破坏了。相反地，如果这个cassette exon被skipping了，那么完整的蛋白将会表达。
要达到基因表达水平的下调，策略有很多，可以是直接的miRNA或者siRNA，也可以是利用基因之间的此消彼长之关系。但是似乎，任何基因调控策略，最终都无外乎要回到这个问题：
figure_1： 单个细胞的基因水平下调
如figure1，这就是典型的单细胞水平下调基因表达。我以某种策略来干扰某个exon是否inclusion或者skipping。发现按照这种策略，有70%的毒性exon发生skipping了，mRNA功能完整、蛋白完好无损，基因开启（ON）。而另一方面30%的毒性exon发生inclusion，mRNA被毒害继而蛋白破损，基因关闭（OFF）。
所以可以看见，单个细胞水平而言，胞內存在两种mRNA，一种是完好mRNA、一种是被毒害的mRNA。因为完整mRNA的水平就只有70%，继而单个细胞就只有70%的表达量。
figure_2： 单个细胞基因表达命运的决定
如figure2，在这种实验基因下调策略之下，一定概率性地抑制了毒性exon的skipping。与figure1里的单细胞不同，此时每个细胞里只存在一种mRNA，要么是完整mRNA，要么是被毒害mRNA。与其说这种策略是一种对基因的下调，不如说是细胞命运的真·决定。
看了下面的对比图figure3也许你可以理解这个蛋疼问题的生物意义：
figure_3：二者的巨大区别
A和B是代表一坨细胞或者一个菌落（所以你并不知道具体每个细胞的情况），假设这些细胞都表达GFP而发绿光。经过你设计的基因下调策略处理，你确确实实看见，相对于WT，基因表达水平变成了70%，成功被下调了。但是，你能分辨出究竟是单细胞都表达70%（如A），还是只有70%的细胞表达了蛋白（如B）？究竟是所有细胞都成功被弄二了呢，还是只是因为你人品好有倒霉的30%细胞中招了？
阴性对照、阳性对照、挽救（rescue）策略，这三种常见的对照策略，都无济于事。那么，怎么半？
难道只能单细胞测序了么？
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【后记】
1. 我之所以说一般基因工程是根本不care这些问题，是因为最终结果里基因表达水平被下调就好了。我之所以再说，这样的研究很危险，是因为如果不关心具体情况，很有可能其实是假象，正如figure_3B所示，万一造成那30%被下调的原因是偶然？或者是其他原因呢？（所以此刻重复实验有意义了）
2. 目前“市面上”有很多所谓determine cell fate的研究，要我说，其实很多都是如图figure1的研究，太极拳似的、中药似的来决定细胞命运，就是慢慢磨死你；如果真·细胞命运决定，就应该像figure2那样，立竿见影，要细胞向东走，绝对不会“西北-北-东北”慢慢转向东边，而是直接一个后空翻向东。
不过怎么做真·命运决定呢？我暂时没想到。而且可悲的是，我还不能找到让自己信服这样做的意义。毕竟无奈就像找妹子一样，死缠烂打厚脸皮纠缠才是王道。
3. figure1-3自己绘图，忘记附上中文了。
4. 如果能有办法做出判断，那合成生物学就能做出来。如果能确定对单细胞有效果，那就能做出真·调控装置；如果确定是拼概率，那就能做真·命运决定装置。不论哪样做，synbio都可以做出有意义的装置
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