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细胞生物学是从细胞整体、亚显微结构和分子水平三个层面来研究细胞的结构及其生命活动规律的科学,是生命科学中一个极为活跃并快速发展的研究领域。近年来,通过利用细胞生物学和分子生物学、遗传学、发育生物学等研究相结合的手段,对细胞进行显微观察,探讨其功能、分化、成长、衰老、死亡的生命活动规律,已成为细胞生物学研究的前沿领域。近年来,成像技术的发展使我们对生物系统的认识和了解又前进了一大步。特别是21世纪以来,打破光学分辨率极限的超高分辨荧光成像技术在理论层面和实际应用层面都得到了长足的发展。目前被广泛地应用于生物科学研究的超高分辨率荧光成像技术主要分为三大类, 基于受激发射光淬灭(stimulated emission depletion, STED)技术, 基于单分子开关的超高分辨率定位技术( 包括光激活定位显微成像术(photoactivated localization microscopy, PALM)和随机光学重构显微成像术(stochastic opticalreconstruction microscopy, STORM)),基于结构光成像的超分辨率技术(structured illumination microscopy, SIM)。PALM/STORM的分辨率最高,可以达到25nm,STED的分辨率次之,达到60nm,而线性SIM是光学分辨极限的一倍,达到100nm,非线性SIM的分辨率更高,但是目前还没有商品化。尽管线性SIM 超分辨显微镜的分辨率不及STED 和PALM/STORM,但是,后二者需要很强的激发光来照明样品,对样品和荧光染料有特殊的需求,所以当前在生命科学领域最常用超高分辨荧光显微镜的还是基于线性SIM技术。
云南大学生命科学研究中心在显微成像平台建设方面得到了校方的大力支持,目前已经建立了模式生物影像及显微操作平台和活细胞影像平台,前者包括蔡司激光共聚焦显微镜LSM880 with Aryscan、蔡司正置荧光-DIC显微镜、以及用于秀丽线虫、斑马鱼、小鼠等模式生物显微注射的相应显微操作设备,后者包括本平台主要用于在高时空分辨率的情况下,长时间观察快速的生命变化过程,包括在亚细胞水平以及分子水平上,在生理状态下观察细胞内的精细结构变化,以及蛋白等生物大分子间相互作用过程。该平台由一套活细胞高速激光共聚焦同步成像全内反射显微镜、一套高速激光共聚焦成像显微镜、一台研究级体式荧光显微镜、一台研究级宏观变倍显微镜、一台倒置荧光显微镜组成。其中,高速激光共聚焦同步成像全内反射显微镜包括大视场双转盘共聚焦扫描头、全固态激光光源、全视场sCMOS荧光探测器、大视场双波长荧光分屏器、研究级全自动倒置荧光显微镜、包括6D精确同步控制系统及数据处理软件在内的图像工作站等六部分组成。高速激光共聚焦成像显微镜由双转盘共聚焦扫描头、单光子探测器、研究级全自动倒置荧光显微镜、图像工作站等四部分组成。
虽然蔡司激光共聚焦显微镜LSM880 with Aryscan的分辨率可以达到140nm,但是距离线性SIM的100 nm还是有较大差距,在成像效果上的区别也是一目了然的。
目前中国市场上应用比较广泛SIM显微镜有两个品牌:GE和NIKON,GE的SIM显微镜原来是美国API(Applied Precision)公司的,后来公司被GE收购。API公司SIM显微镜称为OMX,OMX系统最初由加州大学旧金山分校(UCSF)的John Sedat和David Agard联合开发,第一套系统称为OM0,是世界上第一套宽场去卷积显微镜。2000年,M. G. L. Gustafsson在Journal of Microscopy独自一人发表了题为“Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy”的文章,标志着SIM技术的诞生。Gustafsson和Sedat与Agard是同事,1999年曾联合在Journal of Microscopy发表了一篇文章:I5M: 3D widefield light microscopy with better than 100nm axial resolution。所以,Gustafsson参与了后来API公司OMX超分辨率显微镜的开发,如此看来,GE的OMX应该是最正宗的SIM显微镜。
目前,GE的SIM型号是DeltaVision OMX SR,3D-SIM超高分辨率模式下X, Y轴分辨率为≤ 110nm,Z轴为≤340 nm(488 nm激发情况下,要求XY轴分辨率和Z轴分辨率可同时达到);兼容目前常用荧光蛋白(如EGFP、RFP)和荧光染料(如DAPI、Hochest、Alex 488、Alex 568、Cy5)。除了2D和3D SIM超高分辨成像外,DeltaVision OMX SR还可以做宽场成像、延时成像、去卷积成像,以及TIRF照明。配备的固体激光器有:405 nm,488 nm,568 nm,640 nm。每个激光器直接输出功率达到100mW,光纤出口功率≥60mW;所有波长均可用于超高分辨率成像,且光纤出口功率可自动校准。
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GMT+8, 2024-11-23 10:35
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