本文是我在博士阶段写的基础综述。这篇综述花了我相当长的时间，我看了王晓东实验室所有的文章，甚至将他讲课的故事和他E-mail给我的essay都揉了进来，思路是理清楚了，语言却还是晦涩的，有些甚至是卖弄的和夸张的。本来想着有时间再整理润色一下，然而交差之后一年过去了，这篇文章却仍然躺在电脑的某个角落。我相信对王晓东感兴趣的人很多，却少有人真正去研究他的文献，理解他的工作思路。尽管文字晦涩，相信感兴趣的人还是能从这篇综述中获得某些信息。物该尽其用，把它贴出来，权当献给Biology板的圣诞礼物吧。

凋亡的线粒体途径－王晓东的科研思路追踪

关键词：调亡、程序性死亡、线粒体、caspase、王晓东

摘要：凋亡的线粒体途径是生物学界阐明得最为明确的信号通路之一，是发展最为迅速的领域之一。在此领域中贡献最大的当属华人科学家王晓东。他利用经典的生化技术无可辩驳地发现并梳理了这一通路。本文通过系统研究王晓东的论文，试图追踪王晓东的科研思路，并以此为主，再现这一领域激动人心的发现历程。

故事外的故事

四年前，我在走进教室的时候碰到了风尘仆仆的王晓东。王穿着灰色调的衣裤，背着一个很土的绿包，身体不是很挺拔，脸宽大且棱角分明，要不是走路的时候有一些坚定，很容易被别人当作进城的打工汉。他从最简单的开始讲起，科研需要三板斧，要是能掌握两板也不错……渐渐地教室的气氛有点反常，好像大家都在屏息一样：他在讲他和学生刘雪松进行纯化蛋白比赛的故事……及至他用漂亮的数据图将结果展现给我们的时候，我们才象听了一次武侠传奇一样如梦方醒。王循序渐进、清晰明了、讲故事般的授课方式给我留下了很深的印象。为了加深这种印象，两年之后我又和师弟师妹们一起再次听了他的课。而当时我刚好有纯化一个未知因子的打算，于是我浏览了他的实验室主页。在我粗粗翻阅了他发表的文献之后，我惊奇地发现他的重要发现基本上都是用“建立体外检测体系－跟踪纯化活性”的模式进行的。我对这一模式的有效性产生了很大的兴趣。当我在博士三年级被要求写综述的时候，我决定研究他的论文，把这一模式彻底搞清楚。


从博士后研究开始-技术训练与选题的由来

1991-1995年，王晓东在美国德克萨斯大学西南医学中心进行博士后训练，师从诺贝尔奖获得者Joseph L. Goldstein 和 Michael S. Brown教授，从事胆固醇调节基因的表达调控的研究。1993年，王和他的同事利用gel shift assay跟踪纯化，从Hela细胞核中分离出了与低密度脂蛋白promotor的调控序列相结合的蛋白SREBPs1,2。这是王最早操练“体外assay跟踪纯化进程”的方法，王正是利用这种方法随后在凋亡领域做出了一系列令人炫目的实验。SREBPs是膜定位蛋白，它的膜结合域被蛋白酶切除后，才能进入核内，调控低密度脂蛋白的表达。基于SREBPs被细胞裂解液中的蛋白酶活性切为两个片断的现象，王晓东建立了体外assay，跟踪活性，通过不同性质的一系列纯化柱，部分（partially）纯化到了这个蛋白。对蛋白的两个片断序列分析表明它与后来统一命名的Caspase 3 (cysteine-containing aspartate-spicific protease)同源3。而之后的实验表明Caspase 3本身在细胞凋亡中也能够剪切SREBPs，凋亡通路通过这种方式干扰膜蛋白的代谢，从而导致细胞膜泡状化（blebbing）4。研究的不断深入将王晓东的目光从胆固醇调节基因转向了凋亡。

传奇的前奏-细胞调亡的研究背景

细胞凋亡是由基因编码控制的程序化死亡。凋亡的细胞形态上发生很大的改变：胞体变小，胞浆浓缩，核染色质密度增高，细胞膜内陷形成凋亡小体等。最后凋亡的细胞被巨噬细胞吞噬而消亡。细胞凋亡在胚胎发生过程负责清除多余的细胞。在当时，人们用遗传学的方法鉴定了三个控制线虫发育过程中细胞凋亡的基因：ced-9 ，ced-3和ced-4。基因ced-9编码的蛋白抑制细胞凋亡，已知它在人中对应的蛋白是bcl-2；而ced-3和ced
-4编码的蛋白则促进细胞凋亡。其中ced-3基因编码一种富含丝氨酸的蛋白酶。1993年，复旦毕业的华人学生袁钧英用蛋白序列分段检索的办法巧妙地找到了ced-3蛋白在人中的同源蛋白：它们隶属于ICE（interleukin-1-converting enzyme）蛋白酶家族5。其中caspase 3 的序列和功能与ced-3最为接近。Caspase 3特异地在天冬氨酸残基的位置剪切底物蛋白（比如前面说的SREBPs），而自己本身在细胞凋亡中也在天冬氨酸的位置被剪切为两个片断。人们推断有一个caspase级联（cascade）放大的过程控制凋亡的发生。当时生物学界蓄势待发，很多生物学家都酝酿着回答这个问题：细胞是通过什么途径执行凋亡程序的6。

核心故事－凋亡体（apoptosome）的发现

    1995年王晓东完成博士后训练，组建了自己的实验室。他显然已经决定将寻找凋亡通路中的蛋白定为实验室未来的研究方向。
    顺着以前的研究而上，他首先想鉴定直接剪切caspase 3的蛋白酶究竟是什么。当仓鼠肝细胞组织匀浆液与caspase 3温育后，caspase 3被其中的蛋白酶剪切成两个片断。追踪这个活性，他实验室纯化得到了这个蛋白，测序结果显示它也是一个ICE蛋白酶的成员，与人的caspase 2高度同源7。仍然是“体外assay跟踪纯化进程”这一套，王已经掌握程咬金的“三板斧”了。
王晓东意识到caspase 3的剪切是凋亡的一个简单的检测指标，通过它建立体外assay，跟踪活性，可能可以找出细胞凋亡的通路。首先他想找到在体外能刺激启动凋亡的小分子。他把手头有的激酶、去磷酸酶抑制剂、核苷酸等，加入到未启动凋亡的Hela细胞质裂解液中。非常幸运地，他筛选到ATP或dATP能够激活细胞裂解液的凋亡反应：1、caspase 3 被剪切激活，2、下游分子PARP和SREBP能被激活的caspase 3剪切，3，当用激活的细胞质裂解液与仓鼠肝细胞的细胞核温育，细胞核的DNA被分解成核小体片断大小的DNA，这是细胞凋亡的经典指标。
    借助于caspase 3被剪切和细胞核DNA分解这两个assay，王对细胞质裂解液进行分级纯化，跟踪引起凋亡的活性组分。当他们过第一个纯化柱后，发现结合在柱子上的蛋白和通过柱子的蛋白只有重新混和在一起后，才能对dATP有凋亡反应。这表明两个组分可能分别代表一个凋亡反应蛋白。通过固定一个组分跟踪另一个组分的方法，王和他的第一个学生刘雪松展开了竞赛：看谁先纯化到其中的一个蛋白。但是老革命被新兵打败了。刘雪松发现用50％（90％？）硫酸铵沉淀组分后，活性成分仍然处在上清中，而此时的上清其它蛋白已经很少了，很快地，刘雪松把组分纯化到了一条带。传奇有时候是由巧合加运气造就的。这条带在PAGE胶上竟然是紫色的。王对它的光谱进行分析，发现它的光谱与细胞色素C一样，而蛋白测序的结果也确证了这个结论。王对于花这么大功夫纯化到在公司可以轻易买到的蛋白感到万分沮丧，而细胞色素C是线粒体电子传递链中的组分，它本不应该分布在细胞质裂解液中，另外对于线粒体在凋亡中有什么作用，王是没有一点头绪。
    慢着！前面提到的抑制凋亡的bcl-2蛋白就是分布在线粒体外膜上的。当用细胞色素C的抗体特异地除掉细胞色素c后，细胞质裂解液也不对dATP反应。进一步地，王证明是因为破碎细胞的时候过于粗暴，线粒体在制备细胞质裂解液中被破坏了，如果加入蔗糖保护线粒体，裂解液将不再对dATP起凋亡反应（错误造就了发现！）。最后，如果用凋亡分子刺激细胞，王发现细胞色素c的确从线粒体释放到细胞质中。这些实验无可辩驳地证明了线粒体参与了凋亡的反应6。
    王晓东纯化的那个组分在过另外一个纯化柱后又分成了两个必需组分，顺理成章地，这两个组分最后被纯化并命名为Apaf-1和caspase 98,9。谜底揭开了：Apaf-1正是线虫ced-4在人中的同源蛋白，而这些结果进一步说明细胞色素c在凋亡中的作用无可置疑。
    王将研究的注意力集中在阐述这三个蛋白的相互关系上。
    Apaf-1通过N端的CARD结构域与caspase 9相互结合，通过C端的WD结构域与细胞色素c相互结合，通过Walker’s结构域与ATP/dATP相互作用。因为与Apaf-1共沉淀的多为ADP而非ATP形式，加之不能水解的ATP类似物AMP-PNP或者ATP-γ-s不能导致caspase 3剪切，王当时推测ATP的水解是必需的。但是同期与其他科学家合作的发现让王重新审视了这一设想：通过比较Apaf-1和在果蝇中的同源蛋DARK的序列发现，原先被认为负责ATP/dATP降解的两个氨基酸在DARK中并不保守，这提示ATP/dATP的降解在凋亡反应中也许并
不是必须的。进一步的实验结果验证后者才是正确的：与纯度更高的Apaf-1/caspase 9/cytochrome c复合体结合的主要形式是dATP而不是dADP；复合体在凋亡前后结合的dATP并没有被降解为dADP；ATP的另外一个非降解类似物ADPCP同ATP一样可以启动凋亡。
    通过重组表达蛋白的体外重建系统，以及后来与其它实验室合作对复合体结构的研究结果，王的实验室清晰地描绘了这些蛋白在凋亡中相互作用的情景：细胞收到凋亡信号刺激后，细胞色素c从线粒体中释放到细胞质，它与Apaf-1作用增进了与ATP/dATP的结合，与ATP/dATP的结合使Apaf-1蛋白CARD结构域相互作用多聚化，形成的含有7轴对称的蛋白和核苷酸的复合体被命名为凋亡体。凋亡体中的Apaf-1结构发生改变，招募caspase 9并导致caspase 9被剪切成两段，从而被激活。激活了的caspase 9进一步地剪切caspase 38-12。
王的以上发现在生物界扔了一颗重磅炸弹，很多科学家参与到细胞凋亡的领域中来，竞争开始变得非常激烈，而凋亡的研究也在飞速发展。

乘胜追击-凋亡体上游与下游执行蛋白的发现

    顺流而下，capspase 3的激活导致了细胞核DNA被剪切成核小体DNA大小的片断，那么中间的执行者是什么蛋白呢？如果将激活的caspase 3加入Hela细胞裂解液并与仓鼠肝细胞核温育，细胞核内的DNA被剪切成片断。这说明裂解液中存在执行蛋白。通过以上的体外assay，跟踪裂解液纯化的过程，鉴定出两个异源二聚体蛋白：DFF45和DFF4013。DFF40是其中的活性蛋白，DFF45是DFF40的伴娘分子（chaperone），如果没有DFF45共表达帮助折叠，单独表达的DFF40没有剪切染色质DNA的活性。同时DFF45抑制DFF40的活性，DFF复合体本身没有活性，激活的caspase 3把DFF45剪切成片断后，DFF40才从复合体中释放出来行使功能13-16。
    在纯化DFF的时候王发现了一个奇怪的现象：被激活的DFF与细胞核温育可以剪切染色质DNA，但是基本上不剪切裸露的DNA。这促使王考虑到可能在核内存在着另外的因子介导或者帮助DFF40切割染色质DNA。DFF40本身有剪切裸露DNA的微量活性，但是当加入细胞核裂解液后这种活性得到了提高。据此建立assay，对细胞核裂解液进行分级纯化，鉴定出这个蛋白是HMG-217。相似地，HMG-1和histone可能通过招募的方式也能提高DFF40切割裸露DNA的活性15。
DFF敲除的老鼠细胞仍然在调亡刺激后有残余的剪切染色质DNA的活性，表明除了DFF以外有其它因子负责剪切染色质DNA。当时其他科学家已经发现AIF能从线粒体中释放并能直接导致细胞核染色质的片断化。王想系统筛选出另外的从线粒体释放并直接导致细胞核染色质DNA片断化的因子。它将线粒体和细胞核温育，当加入刺激线粒体释放cytochrome c（认为此时其它因子也一起从线粒体释放）的因子后，细胞核染色质DNA发生片断化。据此建立assay，将处理后的线粒体上清蛋白进行分级纯化，鉴定出了endonuclease G蛋白。endonuclease G是线粒体特异的核酸酶，它单独就能够剪切细胞核染色质DNA和降解裸露的DNA。Edonuclease G 的发现进一步说明了线粒体能存在一种途径不依赖于caspase而导致调亡事件的发生18。
    逆流而上，王想知道什么因子影响了线粒体cytochrome c的释放。早在发现cytochromec在凋亡的作用后，本能的反应也应该是另外一个分布在线粒体外膜的凋亡蛋白bcl2与cytochrome c有没有什么关系。王找到两个细胞株：bcl2低表达的HL-60 neo和bcl2高表达的Bcl-2。用调亡刺激物刺激后，前者启动了调亡，cytochrome c释放，而后者则启动调亡，也没有cytochrome c的释放。这个结果表明bcl2可能通过抑制cytochrome c从线粒体的释放来抑制调亡的19。
    进一步地，王建立了以下assay鉴定刺激细胞色素c释放的因子：加活性形式的caspase 8到细胞质裂解液，与线粒体温育，cytochrome c释放。据此，对裂解液进行分级纯化，鉴定出蛋白tbid。Caspase 8剪切tbid，tbid的C端片断从细胞质中转位到线粒体，引起细胞色素c的释放。Bcl2可以与tBid结合并拮抗它诱导细胞色素c释放的功能20。
    对实验现象的敏锐观察往往能有新的发现。王在实验中发现，在体内，2小时UV照射后的细胞分离出来的线粒体才能观察到细胞色素c的释放和Bak的寡聚化（Bak寡聚化后被认为在线粒体膜上形成了孔道供蛋白通过，Bak的寡聚化是调亡的另一个指标）。在体外，30分钟UV照射后的细胞分离出来的线粒体，在37度温育30分钟后即可以看到等量Bak寡聚化以及细胞色素c的释放。体内的细胞色素c的释放相比于体外至少被延迟了一个小时。这进一步肯定了体内存在抑制细胞色素c释放的因子。将UV照射1小时后分离的线粒体与未照射的细胞质裂解液混和，发现后者具有抑制细胞色素c释放的活力。跟踪这个活力对裂解液进行半纯化，用已知的Bcl-2家族蛋白的抗体发现活性成分包括Mcl-1和Bcl-XL。进一步的实验发现，UV照射导致Mcl-1蛋白合成的停顿以及Bcl-XL从细胞质中转位到线粒体。前者是后者的上游事件21。
    Smac的发现是另外又一个小现象大发现的例子。在研究apoptosome过程中，王发现如果在制备细胞裂解液的溶液中加入去垢剂，caspase 3的被剪切活性会增加，而制备了裂解液后再加入等量去垢剂则不具有这种效应。很显然的一个推断是去垢剂增加了膜蛋白的溶解，即某种膜蛋白能提高这种活性。果然，细胞膜沉淀后用去垢剂重新溶解的样品具有提高这种活性的能力。依此建立assay，对细胞膜样品分级纯化，得到了Smac蛋白。通过生化实验以及与华人施一功实验室解晶体结构的合作研究，王得到了一系列重要发现。在调亡过程中，Smac从线粒体中释放出来，通过与IAP（caspase的一类抑制蛋白）相互作用，释放出与IAP结合的caspase，从而解除了IAP对caspase的抑制。在研究中，王偶然发现GST融合表达的Smac完全没有活性，这提示Smac的N端是极其重要的。SmacN端的四个氨基酸与它在果蝇中的同源蛋白非常保守。进一步分析发现，体外合成的这四个氨基酸就有拮抗IAP的功能。Smac发现之后，其它实验室发现了另外一个拮抗IAP的蛋白Omi/protein22-24。
    值得一提的是，同时期的科学家的发现完善了调亡的线粒体途径。由于该领域激烈竞争，王对Smac以及之前的endonuclease G研究的结果都是和其它科学家的结果同时发表在一个期刊上。而更多的蛋白纯化鉴定出来之后发现别人已经对它有研究了。不过王的结果都是用体外重建的方式清晰阐明的，这些结果进一步梳理了调亡的线粒体途径（图二）。

超越－新的视角，新的起点

    以上的重要发现让王晓东获得了荣誉，也使他有能力重新审视这一切，决定新一轮的研究方向。
    早在2000年，王晓东就曾雄心勃勃地想通过体人工脂质体体外重建细胞色素c从线粒体中释放的过程。这表明他的雄心早已超越他的成就。尽管这一计划没有实现，但他因此而发现了磷脂Cardiolipin能帮助活化的tBid定位到线粒体25。
    王晓东回溯过去最开始对cytochrome c的研究，难道当初筛选到dATP就是运气吗？筛选几个区区的分子竟然就筛到了，那么体内应该有和dATP类似功能的能启动细胞质裂解液调亡程序的小分子吧？这种小分子还有可能用于开发药物。通过检测caspase 3的活性，王筛选了2万中细胞成分，结果发现小分子PETCM能够象dATP激活caspase 3。跟踪活性分级纯化，活性成分分成三组Q-ft（包含cytochrome c），Q30（包含Apaf-1和caspase 9）,Q100。这三个组分重新组合后加入PETCM并不能激活caspase 3，而需要微量的dATP。这表示在总裂解液中内源的微量dATP支持PETCM激活caspase 3的活性。对Q100进行纯化后发现活性组分是三个相互间高度同源相互结合的PHAP蛋白。但是纯化后发现单独的PHAP与Q-ft和Q100就能激活caspase 3，并不需要PETCM。但是如果再加入Q100，PHAP就失去这种能力，需要PETCM加入才能激活caspase 3。这表明Q100中有PHAP的抑制蛋白。对这种抑制活性进行跟踪纯化，发现它是Pro T蛋白。进一步的体内体外实验表明：PHAP促进caspase 9的激活，ProT抑制调亡体的形成，而PETCM则解除ProT的抑制效应。这些发现也帮助解释了以前一直困扰的问题：为什么当初dATP需要加超过生理浓度很多时才能激活调亡反应26。
细胞调亡基础研究的快速发展也为应用做好了准备。例如Smac的N端氨基酸促进调亡的作用有可能用于开发治疗癌症。王与其他人合作，积极进行这方面的研究27。此外王晓东还将“建立体外检测体系－跟踪纯化活性”的模式用于研究RNAi的机理，从果蝇中纯化到了R2D2，它与Dicer 2形成的复合体能够与siRNA结合并加强指向的mRNA的降解28。

结语

    由于王晓东的研究逻辑清晰，方法简单明了，在按时间顺序阅读文献的过程中，通过预测文献的内容以及当年王晓东即将开展的工作，我得到了象看推理小说一样的乐趣。而预测之外的许多工作都让我茅塞顿开，受益匪浅。正是这些乐趣与受益支撑我花很多时间和努力看完文献并写下此文。
    这种受益是全面的：不同assay的微小差别决定了纯化得到的蛋白的不同；体外重建的清晰性给我留下了很深的印象；我发现有几篇文章的内容和质量都远远超出所发表杂志的要求，而国内实验室肯定会牺牲竞争需要的时间往高分杂志投，或者将文章拆成几篇；文章文字的简洁；通过突变分辨是自剪切还是其它蛋白的剪切；体外实验应该取得体内实验的支持；为了确证最好用不同的细胞株不同的调亡刺激重复实验；对于王晓东为何在高度竞争的领域能一直处于领先，我有了自己的一些猜测；对于调亡的研究，我有了自己的一些想法……


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