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SPATCH：高通量亚细胞空间转录组学平台

已有 284 次阅读 2025-1-10 18:09 |个人分类:科普|系统分类:科普集锦

SPATCH：高通量亚细胞空间转录组学平台

空间转录组学（Spatial transcriptomics，ST）将高通量转录组分析与空间背景组织结构相结合，通过将分子谱与其空间背景联系起来，弥合了单细胞RNA测序（scRNA-seq）的空白。通过保留空间信息，该技术提供了对细胞状态、组织和细胞间相互作用的前所未有的深入了解。它的应用跨越多个生物学科：在神经科学中，它可以实现神经回路和分子连接的高分辨率映射；在发育生物学中，它阐明了组织形态发生的分子机制；在癌症生物学中，它提供了肿瘤微环境和免疫景观的详细特征。空间转录组学技术在其变革潜力的推动下，经历了快速的发展和创新。

ST技术可以大致分为基于测序（sequencing-based spatial transcriptomics，sST）和基于成像（imaging-based spatial transcriptomics，iST）两个平台，每种平台都有不同方法和固有优势。sST平台能够使用poly(dT)寡核苷酸进行无偏全转录组分析，以捕获空间条形码阵列上具有poly(A)尾部的目标序列。这些平台在捕获效率、转录物扩散控制和空间分辨率方面各不相同，范围从微米尺度到纳米尺度。知名平台包括Visium、DBiT-seq、Pathoo-DBiT、Stereo-seq、Slide-seq、Slide-seqV2、HDST、sciSpace、PIXEL-seq、Seq-Scope、MAGIC-seq和Open-ST。相反，iST平台利用荧光标记探针的迭代杂交和序列成像来实现原位基因谱的单分子分辨率。iST技术在探针设计、信号放大策略、成像方式和目标基因方面有所不同。著名的平台包括ISS、CosMx、Xenium、MERFISH、seqFISH、osmFISH和STARmap。这些互补方法强调了ST的优势，sST提供全面、公正的转录组覆盖，而iST提供高分辨率、靶向的基因表达。

已经做出了一些努力来测试sST和iST技术。Yue等人对不同sST平台进行了综合评价，包括0.5 μm测序点直径的Stereo-seq和55 μm分辨率的Visium。对于iST平台，Xenium，MERSCOPE和CosMx使用200到1000个基因的基因面板进行比较。一项涉及四个iST平台的比较研究利用内部和公共数据进行，基因面板多达345个基因。此外，Austin等人使用公共数据集评估了6个iST平台，面板大小从99到1147个基因不等。虽然这些研究提供了有价值的见解，但它们主要集中在空间分辨率较低或基因面板大小有限的ST技术上。此外，许多基准研究依赖于在不同实验条件下或不同组织类型下生成的公共数据集，这些数据集往往缺乏一致的基础真值数据，无法进行稳健评估。因此，现有努力只能提供对ST技术最新进展的部分了解。这强调了迫切需要在统一实验条件下进行系统的基准研究，以全面评估当前高分辨率高通量ST平台的性能和比较优势。

ST已经取得了显著进步，商业平台现在实现了亚细胞分辨率和高通量基因检测。在sST平台中，华大基因的Stereo-seq v1.3利用空间排列的DNA纳米球上的poly(dT)寡核苷酸捕获RNA，分辨率为0.5μm。10x Genomics的Visium HD利用原位印刷poly(dT)寡核苷酸捕获具有poly(A) 尾部的探针，以2 μm的分辨率靶向18,085个基因。与此同时，iST平台，如NanoString公司的CosMx 6K和10x Genomics公司的Xenium分别依靠荧光标记探针和序列成像来分析6175和5001个基因，并且提供单分子精度。这些进步强调了迫切需要一个系统基准，以便在这个快速发展的领域实现更明智应用和持续创新。

在这项研究中，Ren等人收集了来自三种癌症类型的临床样本，并生成了一系列组织切片，以系统地评估五种高通量亚细胞分辨率ST平台。为了建立真实数据集，作者们使用CODEX对每个ST平台对应的相邻组织切片中的蛋白质进行了分析。同时，对相同样品进行scRNA-seq以提供比较参考。作者们手工标注了scRNA-seq和CODEX数据的细胞类型，以及H&E和DAPI染色图像中的细胞边界。利用这些综合注释，系统地评估了每个平台在关键指标上的性能，包括灵敏度、特异性、扩散控制、细胞分割、细胞注释、空间聚类和转录蛋白比对。由此产生的统一生成、处理和注释的多组学数据集包括8,133,524个细胞，可作为推进计算方法开发和实现生物学发现的宝贵资源。为了便于访问，作者们开发了一个用户友好的Web服务器SPATCH（图1，http://spatch.pku-genomics.org/），用于数据可视化、探索和下载。

图1 SPATCH数据库

在这项研究中，作者们对五种商业化的高通量亚分辨率ST平台进行了综合基准测试。为了确保评估的可靠性，他们对临床样本进行了统一处理，以生成高质量和可比较的数据集。匹配的scRNA-seq和蛋白质组学数据，以及手动注释的细胞边界，提供了可靠的参考基线。考虑到TME固有的复杂性和异质性，这项综合评估为选择最适合特定研究和临床应用的ST平台提供了关键的见解和实践指导。

sST平台提供转录组分析功能，每个平台都具有独特优势。Stereo-seq v1.3采用基于poly(dT)的捕获方法，能够进行无偏的转录组探索，检测广泛的转录本，包括非编码RNA，细菌RNA和病毒RNA。这种多功能性是研究不同生物系统的理想选择，尽管需要更高的测序深度才能达到与Visium HD FFPE等目标平台相当的覆盖范围。另一方面，Visium HD FFPE使用一组预先设计的探针来瞄准18,085个人类基因或19,405个小鼠基因。通过捕获更短的探针而不是完整的mRNA分子，Visium HD FFPE实现了增强的扩散控制，最大限度地减少了空间伪影，并与基于蛋白质的数据集（如CODEX）显示出更高的一致性，使其非常适合需要高空间精度的应用。

与sST技术相比，高通量iST平台，如CosMx 6K和Xenium 5K，提供了独特的优势，也面临着挑战。通过使用荧光探针和高分辨率成像技术，iST平台实现了单分子分辨率，实现了单个细胞内精确的转录物定位。此外，iST平台在原位检测转录本，有效避免了扩散，提高了空间制图精度。这种高空间分辨率和准确性特别有利于分析复杂的组织结构和识别小细胞类型，如淋巴细胞的空间保真度是至关重要的。然而，他们对预定义基因面板的依赖限制了他们执行无偏的转录组全谱分析的能力。虽然CosMx 6K和Xenium 5K扩展了基因面板（分别为6,175和5,001个基因），但它们不如sST技术全面，后者可以捕获整个转录组。因此，虽然iST平台在空间精度方面表现出色，但它们有限的基因覆盖范围可能会限制探索性转录组学分析。

准确的细胞分割对高分辨率空间转录组学至关重要，因为它直接影响下游分析，包括细胞类型注释和空间聚类。与基于H&E染色的平台相比，使用DAPI染色的平台表现出更好的性能。这种差异可能是由于H&E图像中的伪影，例如杂质和气泡，可能被误认为是细胞，以及H&E染色固有的不太明显的核边界。高通量iST平台，如CosMx 6K和Xenium 5K，通过整合多路免疫荧光数据，利用核和蛋白质定位信号，提高分割精度。尽管表现出更不规则的分割形状，但Xenium 5K有效地区分了不同的细胞类型，并最大限度地减少了相邻细胞之间的转录本混合。相反，Visium HD FFPE的分辨率为2 μ m，提供了亚细胞细节，但对单细胞分割提出了挑战，因为单个细胞可能会在多个点上分裂。这些发现强调了在ST平台上实现可靠的细胞分割需要强大的成像技术和优化的计算算法。

本研究存在几个局限性。首先，专注于具有较大基因面板的商业化ST平台，不包括那些具有较小面板或商业可用性有限的平台，这可能会缩小比较范围。其次，CODEX是在相邻的组织切片上进行的，而不是在原始的ST切片上进行的，这提供了必要的参考，但也引入了形态学差异，可能会影响跨平台的直接比较。此外，由于Stereo-seq v1.3依赖于新鲜冷冻切片，其与FFPE组织的比较本身就受到与样品制备方法相关的结构差异的限制。第三，对齐和分割分析利用了商业管道，代表了研究人员常用的标准化工作流程，但可能缺少自定义计算优化的见解。最后，由于只使用了新鲜收集的样本，其发现对存档或长期储存的样本的普遍性仍然不清楚，强调需要在更广泛的样本类型和条件下进一步验证。

尽管存在局限性，但该研究通过对高通量亚细胞分辨率ST平台进行全面基准测试，为空间转录组学领域做出了重要贡献。由此产生的多组学数据集，匹配的CODEX和scRNA-seq数据，以及细胞类型和边界的详细手动注释，解决了空间转录组学高质量基准数据，并为推进计算方法和推动该领域的持续创新提供了坚实基础。

展望未来，iST平台准备扩大其覆盖范围，包括跨不同组织的无偏转录组全谱分析。同时，sST平台有望实现更高的分辨率、更好的扩散控制和更高的捕获灵敏度。这两种平台类型都有望与蛋白质组学、表观基因组学和其他模式无缝集成，以实现多组学分析。这些发展将为复杂组织环境中的细胞相互作用和分子机制提供前所未有的视角，并且促进进一步的发现和生物学见解。

参考文献

[1] Pengfei Ren, Rui Zhang, Yunfeng Wang, Peng Zhang, Ce Luo, Suyan Wang, Xiaohong Li, Zongxu Zhang, Yanping Zhao, Yufeng He, Haorui Zhang, Yufeng Li, Zhidong Gao, Xiuping Zhang, Yahui Zhao, Zhihua Liu, Yuanguang Meng, Zhe Zhang, Zexian Zeng. Systematic Benchmarking of High-Throughput Subcellular Spatial Transcriptomics Platforms bioRxiv 2024.12.23.630033; doi: https://doi.org/10.1101/2024.12.23.630033

以往推荐如下：

1. 分子生物标志物数据库MarkerDB

2. 细胞标志物数据库CellMarker 2.0

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7. EMT基因调控数据库：EMTRegulome

8. RNA与疾病关系数据库：RNADisease v4.0

9. RNA修饰关联的读出、擦除、写入蛋白靶标数据库：RM2Target

10. 非编码RNA与免疫关系数据库：RNA2Immune

11. 值得关注的宝藏数据库：CNCB-NGDC