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你研究的“microRNA”可能不是microRNA
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你研究的“microRNA”可能不是microRNA
MicroRNA（miRNA）是RNA诱导沉默复合体（RISC）的靶特异性组分。除了少数例外，它们是由初级转录本处理产生的，包括由内切酶Drosha识别和切割细胞核中的前体RNA以产生发夹pre-miR，然后由Dicer在细胞质中切割，产生接近22 nt的线性RNA，并将其装载到Argonaute（AGO）蛋白中。在人类中，有4种AGO蛋白具有很高的序列相似性，其中AGO2在大多数组织中最为丰富。MicroRNA作为目标识别序列，将AGO结合到mRNA的3 ‘UTR上，主要通过“种子区”的碱基配对，包括miRNA 5 ’端的2-8核苷酸。
已经发现microRNA影响细胞分化和功能的许多方面，并且在许多类型的癌症中作为癌基因或肿瘤抑制因子。它们在上皮向间充质转化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）的控制中发挥着重要作用，这与癌症转移和化疗耐药有关。 然而，许多被命名为“microRNA”的小RNA的鉴定有效性也出现了问题。例如，在线数据库miRBase（http://www.miRBase.org）列出了超过2700个人类miRNA，然而更严格的存储库MirGeneDB列出了不到600个高置信度人类miRNA。
最近，Orang等人鉴定了几十种miRBase列出的小RNA，它们不结合AGO，因此不具有miRNA功能。尽管有数百篇出版物报道了它们在EMT和/或癌症中的作用。通过比较这些非miRNA与真正miRNA的特征，描述了外源表达实验的误解如何可能导致这些相互矛盾的发现，并提供了一系列实验和生物信息学标准，可用于帮助区分功能性miRNA与被误认为是miRNA的外源性RNA片段。
该项研究将AGO关联（miRNA功能的一个关键特征）作为分离真实和错误注释的miRNA的手段。通过这样做，确定了在EMT上下文中表达的27个“non-miR”，并注意到数百个出版物中他们的特征（图1）。然而，这是一个相当低估的问题，因为只能评估表达高于一定水平的miRNA，并且大多数miRBase列出的miRNA不符合这个表达阈值（无论是在这里，还是在大多数其他情况下）。因此，强烈怀疑会有其他的，可能是数百种，被赋予miRNA状态的“non-miR”，但它们不结合AGO，或者没有达到足以实现内源性功能的表达水平。Kilikevicius等人已经很好地描述了考虑miRNA和靶点的相对细胞水平的需要，以及在分配miRNA功能时应考虑的其他问题。
图1 一小部分带注释的microRNA不结合AGO蛋白
考虑到这一点，并考虑到miRNA过表达实验的解释问题，癌症研究界需要在开展新研究时利用控制良好的miRNA抑制实验作为一线证据。理想情况下，AGO共沉淀实验也会进行，以建立AGO关联，但即使他们从来没有，涉及miRNA抑制剂的实验是确定内源性miRNA是否真实且功能重要的第一步。 有趣的是，大多数“non-miR”仅在细胞系和组织中以相对较低的水平表达，这意味着即使它们能够结合AGO或显示与miRNA功能一致的其他特征，仅表达水平可能会排除内源性影响。这也是将内源性功能作为首要原则，通过早期实施miRNA抑制来实现的另一个原因，将极大地改善被夸大miRNA功能的主张所困扰的癌症领域。
虽然人们认识到，人类miRNA的真实数量可能远远少于被称为“miRNA”的几千个，但仍有论文错误地将miRNA的功能归因于非miRNA。例如，在过去的两年里，有20篇论文报道了miR-663a或miR-663b的作用，其实它们是“non-miR”。这可能部分是由于缺乏明确的指南来识别哪些先前注释的miRNA实际上不是miRNA，尽管MirGeneDB数据库是一个很好的起点，可以检查有问题的miRNA是否具有miRNA预期的长度和前体特征。这些标准与体内RISC复合体中miRNA的存在以及内源性miRNA抑制报告基因表达的能力密切相关。
虽然大多数miRNA是通过典型通路产生的，包括Drosha和Dicer的前体切割，但也有例外，这使得与AGO结合而不是生物发生模式或加工所需的结构特征成为更有用的miRNA状态标准。例如，miR-451的产生不依赖于Dicer，但需要AGO2切割，然后进行额外的核苷酸修剪。在依赖于Drosha和Dicer的miR-486-5p的产生过程中，也需要AGO2来切割。与Drosha无关、依赖Dicer的miRNA也存在，包括5 ‘端覆盖的miRNA，其5 ’端对应于转录起始位点，以及非规范生物发生需要剪接体的miRtron。此外，至少一些较大的ncRNA也编码真正的AGO结合的smRNA，这些smRNA在miRNA通路中起作用，因此miRNA和另一类非编码RNA之间重叠的基因组注释不足以降低miRNA的地位。它们可以由snoRNA、rRNA和tRNA以典型的Dicer依赖方式产生。
不确定性也可能来自小RNA，它们满足人们对miRNA的一些标准，但不是全部。例如，如果一个小RNA与AGO的相互作用很差，它可能仍然能够抑制目标基因，但可能比人们从表达程度上预期的效率要低。这可能是因为新的miRNA不太可能从单一的进化事件中出现，从而导致所谓的“过渡性miRNA”，小RNA在进化成类似miRNA活性的过程中，其基因沉默作用仍然有限。例如，在miR-221和miR-148的情况下，它们与AGO共沉淀的程度只是适度的，尽管两者都是高表达的，因此代表了AGO丰富的miRNAome的重要部分。其他更低表达的RNA，以同样适度的效率共沉淀，其意义更值得怀疑。因此，“边缘”miRNA（除了真实的和错误注释的清单），它们具有一些（但不是全部）人们期望的有效的、进化优化的miRNA特征。
并非所有miRBase v22条目都是真实的，miRBase v22采用了文本挖掘方法来提高对所列miRNA功能的信心，出版物中包含miRNA名称的句子，并为与功能相关的术语（如“表达”，“目标”，“调节”或“抑制”）共存给予正分数。然而，如果存在非内源性小RNA作为miRNA，但基于外源性表达和/或对涉及单个或控制不良的miRNA抑制剂实验的错误解释而被报道为miRNA，则这是有问题的。重要的是，即使是没有在基因组中编码的miRNA大小的序列，在短暂表达时仍然可以表现得像miRNA一样。有报道称，miRNA通过过表达显示出明显的功能，从而重申了它们在miRBase中的列表，这反过来又使未来的研究人员更有可能进行类似的实验。这种循环逻辑导致了数千篇涉及虚假“miRNA”的出版物，包括在癌症领域，这种虚假报道是数千篇癌症出版物的基础。
参考文献
[1] Ayla Orang, Nicholas I Warnock, Melodie Migault, B Kate Dredge, Andrew G Bert, Julie M Bracken, Philip A Gregory, Katherine A Pillman, Gregory J Goodall, Cameron P Bracken. Chasing non-existent “microRNAs” in cancer. bioRxiv 2024.12.05.626946; doi: https://doi.org/10.1101/2024.12.05.626946
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24. HMDD 4.0：miRNA-疾病实验验证关系数据库
25. LncRNADisease v3.0：lncRNA-疾病关系数据库更新版
26. ncRNADrug：与耐药和药物靶向相关的实验验证和预测ncRNA
28. RMBase v3.0：RNA修饰的景观、机制和功能
29. CancerProteome：破译癌症中蛋白质组景观资源
30. CROST：空间转录组综合数据库
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36. SCancerRNA：肿瘤非编码RNA生物标志物的单细胞表达与相互作用资源
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