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Open-ST：3D高分辨率空间转录组

已有 1493 次阅读 2024-7-17 11:24 |个人分类:科普|系统分类:科普集锦

Open-ST：3D高分辨率空间转录组

近年来，空间转录组学(spatial transcriptomics，ST)方法的发展和应用得到了极大的发展。与标准的单细胞方法不同，ST保留了捕获的转录组的空间背景，因此可以直接观察细胞的排列及其在组织空间中的相互作用。这些数据是理解健康分子机制的基础，对于确定和靶向疾病的分子起源至关重要。例如，肿瘤微环境的相互作用或淋巴结的空间结构对了解功能至关重要。此外，ST避免了单细胞分离带来的偏差，单细胞分离会消耗某些细胞类型并激活应激通路。

可提供非靶向转录组捕获的商业ST技术受到其相对较高的成本和/或有限的分辨率的限制，这些技术包括Visium (103 Genomics)、CurioSeeker (Curio Bioscience)和Stereoseq (STOmics)。基于探针的方法，包括CosMx空间分子成像仪(Nanostring)、分子制图(Resolve Biosciences)和Xenium In Situ (103 Genomics)，针对预先设计的基因组，因此不适合无偏发现或空间基因分型。非商业空间技术受到捕获效率低、分辨率低或实验设置费力/具有挑战性的限制。最后，虽然细胞以3D方式运作和交流以及构建功能性组织和器官，但目前还没有端到端的平台来生成和计算分析3D的ST。最近提出的Open-ST被认为是一种具有成本效益的方法，结合了高分辨率和高效的全转录组捕获，以及广泛的实验资源和开源软件，可以进行2D和3D的无缝数据处理和分析。

Open-ST通过将Illumina流动细胞转换为ST捕获区来操作，这是Seq-Scope先前实施的方法。Open-ST包括几个关键的改进。首先，使用模式流式细胞技术创建密集的条形码区域，从组织切片中以捕获点分辨率~0.6 mm的聚腺苷化RNA。为了控制流动池分裂成不同的捕获区域，Open-ST提供了一个3D打印的切割指南。Open-ST简化的文库准备只需要标准的实验室设备，并且每12mm²捕获面积的总成本< 130欧元。

与其他基于测序的技术相比，Open-ST需要最少的测序深度来获得等效的转录组学信息，每个细胞有1000个独特的分子标识符(UMI)，使其具有成本效益。 Open-ST是可扩展的，因为一个研究人员可以在3天内从准备好的捕获区开始准备10-15个文库并且多功能，因为捕获区大小在流动池大小的限制内可调节。Open-ST的苏木精和伊红(H&E)成像管道，对新鲜冷冻样品进行了优化，从相同的切片产生高分辨率图像，Open-ST将其用于细胞分割和转录组数据整合。Open-ST二维数据足够健壮，可以计算集成到三维(“虚拟组织块”)中。单细胞分割、亚细胞分辨率、3D组织重建和查询功能由一系列模块化和开源计算工具提供支持，这些工具专为Open-ST数据设计。这产生了与原始切片方向无关的交互式对象，从而可以发现3D分子模式和潜在的生物标志物。

Open-ST以亚细胞精度概括了几种组织(小鼠和人类)的细胞类型和标记基因。利用胚胎小鼠头部和成年小鼠海马来对照已发表的基因表达数据，对RNA捕获的精度、灵敏度和空间分辨率进行基准测试。

此外，Open-ST可用于研究临床相关组织，包括不同形态和细胞大小(小免疫细胞到大脂肪细胞)。作为原理证明，分析了来自人类头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的患者匹配样本。这种癌症类型已被证明具有高度多样性的转录谱和细胞类型组成，其相对丰度、空间组织和相互作用对生存和治疗反应有影响。在使用Open-ST处理的人类样本的所有21个切片中，可重复地捕获每个细胞中位数为600-2000个空间定位转录本，覆盖超过25,000个基因。结果还表明，Open-ST的文库测序远未达到饱和。

对于人类转移性淋巴结，Open-ST应用于跨越350 mm的连续切片。在H&E染色中嵌入了超过100万个细胞和851个转录本，构建了一个3D虚拟细胞块。在患者匹配的原发肿瘤中，Open-ST重现了转移组织中基质、免疫和肿瘤细胞类型的转录组特征，并通过Xenium试验独立验证。特别是，亚聚类鉴定出原发性和转移性肿瘤中存在的10种肿瘤细胞亚型。这些亚型在原发肿瘤中存在空间模式，但在转移中没有，包括增殖性、炎症性、角化和侵袭性表型，并与细胞-细胞通讯热点的空间定位密切相关，通过配体-受体分析计算预测。通过转移性淋巴结的三维虚拟组织块，在肿瘤和淋巴组织之间的三维边界上发现了一个空间组织的胆固醇生物合成特征和巨噬细胞群体，作为一个潜在的三维生物标志物。