circRNA海绵：广泛分析circRNA表达及其在miRNA海绵中的作用 

环状RNA (circRNA)被归类为长链非编码RNA (lncRNA)，尽管有报道称有少数环状RNA编码蛋白质。环状RNA的特点是其环状结构，这使得它们不容易降解。circRNA的生物发生可以通过前体信使RNA (pre-mRNA)的选择性剪接过程中发生的反剪接事件来解释，其中上游外显子的5’端和下游外显子的3’端共价连接。环状RNA与线性RNA的不同之处在于，环状RNA缺乏5’帽和3’聚腺苷化尾部及其圆形，这使得环状RNA更稳定，并且在大多数情况下，对外切酶活性具有抗性。这些环状分子可以由剪接的pre-mRNA的外显子和内含子区域组成，因此具有各种大小，范围从100 ~ >4000个核苷酸。circRNA在物种中是保守的，其表达具有组织和疾病特异性。因此，它们可以作为生物标志物和治疗靶点发挥重要作用。另一种非编码RNA是microRNA (miRNA)，它在转录后基因调控中发挥作用，并参与许多生物过程和疾病。miRNA通过RNA诱导的沉默复合体，导致靶基因的降解或阻止它们翻译。 

环状RNA、miRNA、编码蛋白质的信使RNA (mRNA)以及共享miRNA结合位点的其他类型RNA之间可能的相互作用产生了一个庞大的调控网络。Salmena等人提出，任何携带miRNA结合位点的RNA（如mRNA、环状RNA、假基因、3‘端非编码区(UTR)转录本和lncRNA的转录本）都可以作为竞争性内源性RNA (ceRNA)，竞争细胞中有限的可用miRNA。这种竞争的结果是，过度表达的RNA可以吞噬其他RNA调节所需的miRNA，这可以解释为什么非编码RNA，如环状RNA，可能与表型有关。 

circRNA稳定性的增强可能允许它们通过结合miRNA作为缓冲，直到存在足够的miRNA超过circRNA结合位点。circRNA的调节功能及其与疾病的关联是鉴定circRNA和miRNA之间的海绵活性特别有趣的主要原因。miRNA和circRNA之间存在相互作用已被反复证实，一些circRNA（例如CDR1as/CiRS-7, SRY和circNCX1）已被认为是miRNA海绵。尽管个别研究证实了circRNA海绵的存在，但还需要进一步的研究来阐明circRNA在miRNA介导的基因调控中所发挥的作用。 

从计算的角度来看，环状RNA的检测是困难的，因为它们的形状是环形的，并且缺乏poly(A)尾部，这使得在富含poly(A)的RNA测序(RNA-seq)文库中不太可能观察到它们。因此，环状RNA只能在没有poly(A)富集的文库中被检测到，例如核糖体RNA (rRNA)耗尽的RNA-seq和总RNA-seq，它们不会耗尽环状RNA。circRNA的鉴定依赖于检测未映射读段之间的反向剪接连接，从而可以估计circRNA的丰度。由于只关注反向剪接连接，circRNA相对于其线性对应物的表达通常被低估了。 

已经提出了几种circRNA分析方法。Chen等人[1]回顾了100种现有的circRNA相关工具，用于circRNA检测、注释、下游分析以及网络分析。他们总共列出了44种circRNA识别工具，包括但不限于CIRCexplorer、find_circ、CIRI、KNIFE和circRNA_finder。他们还提供了从文献中收集circRNA信息的14个circRNA注释数据库，如circBase 和CIRCpedia。其他circRNA相关工具包括用于特征收集和存储与疾病和生物标志物相关的circRNA信息的数据库。此外，circRNA网络鉴定工具可以模拟circRNA与miRNA、lncRNA或RNA结合蛋白之间的相互作用。circRNA下游分析的其他工具包括选择性剪接检测、circRNA组装和结构预测和可视化。目前，没有一种工具能提供综合circRNA和miRNA的鉴定和定量的全面和自动化的circRNA海绵分析，以及对潜在的circRNA-miRNA海绵事件的系统调查和ceRNA网络分析。Hoffmann等人[2]开发了“circRNA海绵”工具，这是一个流式管道，整合了最先进的方法来：(i)从总RNA-seq数据中识别反向剪接连接来检测circRNA，(ii)量化它们相对于线性转录物的表达值，(iii)进行差异表达分析，(iv)从miRNA测序(miRNA-seq)数据中识别和量化miRNA表达，(v)预测miRNA在circRNA上的结合位点，(vi)系统地研究潜在的circRNA-miRNA海绵事件，(vii)创建ceRNA网络和(viii)使用ceRNA网络识别潜在的circRNA生物标志物(图1)。 

图1 “circRNA海绵”工具工作流程。该管道由三个模块组成:(1)circRNA模块，(2)miRNA模块和(3)海绵模块。在(1)中，通过从总RNA-seq数据中识别反向剪接连接来检测circRNAs，量化它们的表达值，进行差异表达分析，并使用三种最先进的方法中的多数投票来预测circRNAs上的miRNA结合位点。在(2)中，要么在原始miRNA-seq中检测和定量miRNA，要么直接处理miRNA表达数据。在(3)中，系统地研究了circRNA-miRNA海绵事件，创建了一个ceRNA网络，并用它来识别潜在的circRNA生物标志物 

作者们展示了“circRNA海绵”工具对来自小鼠脑组织的匹配rRNA耗尽的RNA-seq和miRNA-seq数据的潜力。详细结果与分析见文献[2]，“circRNA海绵”工具可参考https://github.com/biomedbigdata/circRNA-sponging。 

参考文献

[1] Chen L, Wang C, Sun H, Wang J, Liang Y, Wang Y, Wong G. The bioinformatics toolbox for circRNA discovery and analysis. Brief Bioinform. 2021 Mar 22;22(2):1706-1728. doi: 10.1093/bib/bbaa001.

[2] Hoffmann M, Schwartz L, Ciora OA, Trummer N, Willruth LL, Jankowski J, Lee HK, Baumbach J, Furth PA, Hennighausen L, List M. circRNA-sponging: a pipeline for extensive analysis of circRNA expression and their role in miRNA sponging. Bioinform Adv. 2023 Jul 8;3(1):vbad093. doi: 10.1093/bioadv/vbad093. 

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