A story of PI3K (III)

早上6点进Lab到中午11点半离开，这是曾经临近毕业时的节奏啊，可这两天感觉在公司做实验也不错，因为有个结果我已期待很久，今天看到了希望，余下的就是花心思细化实验步骤了。空闲时还是想看一看这篇关于PI3K的综述，因为这里面的示意图给了我许多启示，主要内容参考：

ThorpeL M, Yuzugullu H, Zhao J J. PI3K in cancer: divergent roles of isoforms, modesof activation and therapeutic targeting[J]. NatureReviews Cancer, 2015, 15(1):7-24.

PI3Ks（phosphatidylinositol3-kinases）是磷脂激酶中的一个家族，本身具有Ser/Thr激酶活性，也具有磷脂酰肌醇激酶的活性，与细胞膜上的受体作用，介导外部信号传递入细胞内部，如生长因子、细胞因子及其他环境因素，进而间接影响细胞的增殖、生长、存活、迁移和代谢等过程。文中列举了因PI3K突变诱发的诸多癌症，也表明这类靶点在癌症治疗中的重要作用。以往的研究专注于PI3K的广谱抑制剂（pan-inhibitor），对其异构体并无选择性（non-isoform-selectivity）。随着研究的深入，人们在临床的数据中发现PI3K的异构体表现出多种不同的功能，如今已有PI3K异构体特异的药物进入临床并展示出极大的潜力，也是值得人们角逐的热门领域。

Fig 1  The PI3K familycomprises several classes and isoforms

(Fom Liu, P., et al., Nature Rev. Drug Discov. 8, 627–644, 2009)

PI3Ks主要是在磷脂酰肌醇（phosphatidylinositide，Ptdlns）3’端的羟基上加上磷酸，根据底物和产物的不同主要分为三大类：Class I、Class II和Class III。其中关于I类的研究较为清楚，如图1所示，Class I的底物是Ptdlns(4,5)P₂，产物是Ptdlns(3,4,5)P₃（曾经我对PIP2这里分子不敏感，看到就晕）。PI3K的主要功能域是催化结构域（catalytic domain），根据结伴的调节蛋白（regulatory proteins）的不同Class I又细分两个亚组：Class IA和Class IB。其中Class IA中含有三个同源的蛋白p110（they call it P one ten）α、β和δ，他们可以与五个调节蛋白（p85、及其剪切体p55α和p50α, p85β和p55γ，合称p85型调节亚基，p85-type regulatory subunit）中的任何一个形成异源二聚体（heterodimers）来发挥磷酸化的功能；Class IB中的p110γ与p101或p87。（好多名字，基因名称见Table 1）

值得一提的是p110α和p110β是广泛分布的，而p110δ和p110γ则主要表达在淋巴细胞，这也需要合成isoform-selective的小分子抑制剂的原因之一。Class I中的成员有着一样的催化结构域、螺旋结构合RAS结合结构域（RAS binding domain，RBD），IA可以通过p85-BD与iSH2（inter-SH2）相互作用。

Table1 Genes for PI3K

（From Wikipedia）

无外部信号刺激时p110与p85结合后的酶活性被抑制，当信号经RTK、GPCR传递到细胞内部时，PI3K会被募集到细胞膜处，此时p85对她的抑制会解除，之后p110会将PIP2转化PIP3（图2）。此时的PIP3作为第二信使（second message）将信号传递到AKT依赖的和非依赖的信号通路。对Class II和III的了解相对较少，应用的少，就不在此赘述，感兴趣的朋友可参考图2或阅读原文。

因PI3K通路异常活化而致癌的现象在临床上是最常见的，而最普通的原因是PTEN（Phosphatase and tensin homolog）的功能失常或缺失，PTEN在此处的作用并不是抑制PI3K的活性，他是磷脂磷酸酶（lipid phosphatase），可将PIP3转变为PIP2，抑制PI3K信号通路的活化，是一种负反馈调节（看到这里我就理解为何PTEN缺失或功能失活时细胞容易转变成癌细胞了）；也有可能是RTK、GPCR等活性异常导致PI3K通路过于活化。随着基因组序列的日益剧增，人们在临床上也看到了更多有规律的基因突变。

由PI3K class I引起癌症转化的现象早在二十年前就有人报道，比如p110α融合与病毒蛋白或SRC豆蔻酰化信号序列（SRC myristoylation signal sequence）融合后定位于细胞膜上。直到2004年PI3K被推到名人堂，作为诱发癌症的主要原因（key driver of cancer），她的序列被人们分析一遍又一遍，后来再多种肿瘤细胞中观测到了她的基因序列发生突变。虽说无义的突变随机的分布在基因各处，可是有两个热点突变（hotspot mutations）：螺旋结构中的E542K和E545K、酶活性中心的H1047R。细胞生物学和分子水平已经验证这两处的突变确实可以诱发癌症（几个点诶！就改变了一切！有家族史的确实应该分析一下，精准医疗的理念还是应该值得推广，只是操作时也该注意。）

现在好像有一个技术用的更广泛了——遗传工程改造的小鼠模型（genetically engineered mouse model，GEMM），一个得益于精准医疗的背景，一个凭借CRISPR/Cas9这类精简的技术。PI3K的这些热点突变在小鼠模型中也得到了验证（Jean的团队就是利用Cre/loxP的技术分别敲出了小鼠内部的PI3K的isoforms得到了许多新鲜的结果，试想用CRISPR/Cas9方法建立新的小鼠模型，凭借她们深厚的肿瘤学经验，应该有很多事情可以做）。

Fig 2  Signalling by classI, II and III PI3K isoforms

(Fom Liu, P., et al., Nature Rev. Drug Discov. 8, 627–644, 2009)

关于Class I的PI3K的成员也很有意思，她们的催化结构域非常保守，底物和产物都一样，只是在催化的过程中搭档不同而已，早期人们设计的小分子抑制剂大多数是抑制她们的酶活性，是Pan-inhibitor。后来的研究发现这些isoforms的功能也是具有多样性的，在介导PI3K信号通路过程中对病理的进展和肿瘤的发生有着不同的影响，而揭示这一切的工具主要是GEMM的小鼠模型。p110α基因敲除（knock out，K/O）或p110α酶中心失活的小鼠能存活E10.5，相比而言缺失p110β的小鼠存活仅仅E3.5，但p110β酶中心失活的小鼠却能存活，只是在个头、代谢还有生殖方面有些缺陷而已。这就表明对于p110β而言存在一种不依赖酶活性的支架结构的作用（kinase-independent scaffolding role）；p110δ和p110γ敲除的小鼠能活到成年，只是p110δ的缺失会诱导淋巴细胞、中性粒细胞（neutrophils）和肥大细胞（mast cells）等功能缺陷，p110γ的缺失减缓胸腺细胞的发育、T细胞的活化和中性粒细胞的迁移等。

在介导RTK或GPCR通路时各个isoforms的角色也各异（图3a），活化的RTK的细胞内部YXXM模序中的tyrosine会被磷酸化，之后募集p87类蛋白与PI3K结合，其中有一些可以直接与RTK结合，有的需要与RAS搭配，GPCR通路中也存在类似的现象。如今的实验结果细化了每一个isoform可能有的功能，这为详细的阐明她们的分子机子很有帮助，临床上的用药更会多种多样。这类药的使用估计要伴随着分子水平的检测吧，那么日后医院会肚子完成这部分测序与分析吗？还是一样外包服务呢？若是不知道如此细节的信息，是否不能使用相应的药物呢？若是测试或建模的时间长于患者可能存活的时间呢？对于这类棘手的疾病，患者也只能忍了。

利用异构体特异的小分子抑制剂，人们发现p110α的缺失足以封闭PI3K的信号转导，相比而言p110β的作用就不明显，这可能与分析时使用的细胞中p110α的相对表达量有关，若是过高表达，那么她在PI3K信号通路中是具有显著贡献的。这也就能解释为何在淋巴细胞里p110γ的作用更大一些。而Jean的团队进一步揭示了p110β的显著作用，在小鼠体内，敲除p110α可阻止由于PyMT（polyoma middle T）或HER2引起的肿瘤，而敲除p110β会提升乳腺肿瘤的生长。由此提出一个新的模型：小鼠内的p110α与RTK相关的激酶活性高于p110β，二者可竞争性的与RTK的YXXM模序结合（图3b）。此外，早期的研究倾向于Class I类传递RTK的信号，Class II的针对GPCR。而近期的研究表明p110γ也参与RTK信号的转导。

GPCR是一类具有七个跨膜结构域的受体蛋白家族，与异源二聚体的G蛋白（由G_α和G_βγ两个亚基组成）。之前多数的研究显示PI3Ks只有Class IB中的p110γ会被此通路活化，近几年也有数据显示p110β在这个通路中也有一定的作用，她的C2-螺旋结构域可以结合G_βγ亚基。

Fig 3  Divergent roles ofclass I PI3K catalytic isoforms in different signalling contexts

(Fom Vanhaesebroeck, B., etal., Mol. Cell Biol. 11, 329–341, 2010)

早期临床试验中的大部分PI3K的抑制剂是ATP竞争性的小分子，对PI3K的抑制无选择新，包括pan-inhibitior（如GDC0491）、dual inhibitor（同时抑制PI3K和mTOR的BEZ235）。现在人们更专注与有选择性的抑制剂，目前最为有效的应算Gilead Science的idelaisib（也称Zydelig，p110δ的选择性抑制剂），临床试验用于治疗慢性淋巴细胞性白血病（Chronic Lymphocytic Leukemia）或惰性淋巴瘤（Indolent Lymphoma），已获FDA批准上市。有趣的是这个小分子并非针对PI3K的异常活化，比如PI3K突变或是PTEN缺失，而是干扰了B细胞受体（B cell receptor, BCR）下游信号的转导；特异于p110α的抑制剂如BYL719和GDC0032在乳腺癌中已有报道，主要的副作用是这类抑制剂会干扰胰岛素信号通路和葡萄糖代谢过程，因p110α也参与其中；也有临床数据显示一些PTEN缺失的肿瘤发生依赖于p110β，这也是驱使人们研究她的特异性抑制剂的动力，GSK2636771已进入临床实验。

考虑到PI3K信号通路的复杂性，小分子抑制剂对癌症的治疗也有所限制，人们也在寻找联合治疗，可以结合该通路中的其他成员、或是其他反馈调节通路等等。早期的研究关注mTOR的联合抑制，当人们抑制mTOR时发现可同时PI3K-AKT通路，接着利用dual-inhibitor同时抑制PI3K和mTOR，可又有临床数据表明JAK2-STAT5的通路被激活，不过倒是可以同时用JAK2的抑制剂来克服，只是看起来很复杂，需要更多的数据支持，上一篇博文中也提到了新的联用方式“PI3K+mTOR”在PDX小鼠模型中的新奇效用；还有一种机制会让PI3K相关的肿瘤产生耐药性，就是RTKs的过表达，比如HER3、IGF1受体、胰岛素受体（IR）和EGFR等介导的转录激活。有试验应用HER3的中和抗体LJM716和p110α的抑制剂BYL71联用，在PDX小鼠模型中获得了可喜的结果。

这个领域的进展应该很快，我不太知道这里的历史和细节，只是觉得很多东西比较新，还没有太多成型的药物上市，但进入临床的倒是有一批（可参考原文数据）。有很多机会，也有挑战，静观其变吧，我只是娱乐。

An overview of PI3K inhibitors and their combination with othertherapeutics

(Fom Lauren M. Thorpe, etal., Nature Rev. 15:7-24, 2015)

后记

关于PI3K的故事就写到这里吧，到头来和我没有半毛钱关系，权当浏览新闻吧。倒是让我有个感觉：几个学生在一起忙活，最终发表一篇文章足以作为回报；几个博士或博后在一起忙活，会快速的发几篇文章；几个PI在一起忙活，需要结束一个国家级的科研项目或是解答一个热点的科学问题；几个实验室合作，可以系统的整理一条信号转导通路；几个公司合作，却可以研制一个药物，为人类健康带来福音。想想自己，这么年轻，还处在起跑线上，不知何时还能走多远。

今天凡凡生病了，早上起来有些发烧，一整天没有精神，看着她，看着手里的Paper，有时都觉得可笑。会问：有必要吗？她的妈妈和姥姥围在一边无可奈何，凡凡的脾气大涨，药也不吃，奶粉也拒绝喝，多半是身体不舒服，没有心情，也没有胃口。听着她撕心裂肺的哭喊，我也干着急啊，可是到头来也没啥用。不管怎样，这是孩子必须要经历的，坚持吧！

去药店，取些退烧、感冒的药回来。我想，要不要也试试职业药剂师的考试？这样对凡凡也是有帮助的…可是，我最不擅长，也最讨厌考试了…

或许，可以试试…

TJ  Pharmaron

2016年7月3日星期日