A seminar about therapeutic resistance (II)

昨日的报告很精彩，60分钟的科研报告中我竟然丝毫没有睡意。看到Jean首先show出PI3K的小鼠模型，我便豁然理解之前关于HER2小鼠模型的文章了（Cancer cell，2016），原来她们已经有了近十年的经验。如果说一篇CNS没有什么说服力的话，那么一个Group可以发表若干个CNS，并且可以系统的阐明一条通路，哪怕上下几个节点，这已非常了不起了，更何况她团队的工作和乳腺癌（表皮增生那种病症忘记是什么疾病了）密切相关，为临床提供了许多指导性意见，明眼人都能看到这里面有太多可继续挖掘的机会，或者说她们这种建立PDX模型的方法，很匹配现行的精准治疗，只是耗时过长，还需要有针对性的开展，希望日后能看到更多可喜的结果。

而我目前最关心的是“RTK/GPCR-PI3K-AKT-mTOR-p4EBP1/pS6RP-tumerigenesis”这条通路是什么，我想接着Jean的工作深入了解一番：比如研究信号转导的思路？如何寻找新的队员？如果看其中的一个实验结果，后面我会做如何的设计？如何阐释一种机制等等。听说这条通路主要影响细胞周期，比如细胞的休眠（quiescence）、增殖（proliferation）、癌症和寿命等。曾经看着关于PI3K的通路很复杂，上下游的分子、相互调节的蛋白很多，让我看着就眼花。简化之后会好些，PI3K磷酸化并激活AKT，下游虽说有很多分子可继续传递，我们可以先把目光放在mTOR上，因为一篇文章中发现一种特别的联合用药方法，在PDX模型上可看到明显的抑制HER2阳性乳腺癌的脑转移过程（Jing Ni et al., Nat. Med., 2016）。

（From Jing Ni et al., Nat. Med., 2016）

如上图所示，患者脑部的肿瘤组织被分离后迅速移植入8~10周龄重症综合性免疫缺陷（severe combined immunodeficiency, SCID）小鼠的脑部，精心培养、仔细观察小鼠的病情发展、神经性表型等，比如失重、饮食、行动力、弓背、饮水，甚至和人类临床节点相似的指标，直到最终对其进行安乐死（necessitating euthanasia）。取出小鼠脑部的肿瘤组织，体外转导移植入标记基因，再次转入新的小鼠脑部，在体内进行传代，观察，这时便可以检测药物对该肿瘤细胞增殖的影响，可以通过标记基因监测。看似简单的流程，其实需要及其专业、敬业的朋友才能完成，而且非常耗时间。好在拿到模型以后，人们可以看到许多新鲜的事情，功在千秋。

（From Jing Ni et al., Nat. Med., 2016）

首先要对模型进行验证，比如病理上的表现，比如ER、PR和HER2的表达，比如上皮细胞定位（Cytokeratin 7，CK7）、神经胶质细胞定位（glial markers，如GFAP和OLIG2）等。此外，作者还观察了肿瘤抑制因子PTEN（Phosphatase and tensin homolog）的表达量，在五个患者的PDX模型中均呈阴性，这与临床数据相似，大概有67%（n=27）的乳腺癌患者不表达或较低水平表达PTEN蛋白。这就给人们一个提示：没有增殖（PI3K）的刹车（PTEN），肿瘤细胞大量繁殖是可以理解的。可是不论用HER2激酶的抑制剂Lapatinib还是PI3K的广泛抑制剂BKM120（二者均可透过血脑屏障,BBB）、或是联用，对肿瘤细胞的生长无明显的抑制，应该是哪里不能按常理或现有知识来思考了，这里有新鲜的结果。分子水平看到了药物对下游的AKT和S6RP的磷酸化水平的抑制，可是对mTOR下游的效应分子p-4EBP1的活化并没有明显作用。

到了这里多少理解为何药物对这种肿瘤没有作用了，只是抑制了上游的分子，对下游却没有干扰。WHY？在没有详细解释的情况下只好说哪里发生了改变，可能是DNA突变引起的。查阅文献后发现这并不是新奇的现象，有人报道mTOR的活性可介导乳腺癌细胞对PI3K抑制剂产生耐药性。不妨试一下mTOR的抑制剂RAD001。结果不是很好，不论是单用，还是与Lapatinib联用都不行。可是（总是该有转折嘛），RAD001与BKM120的联用却有惊人的作用！这在两只PDX的小鼠身上看到了明显的效果。看到如此明显的效果，后面再阐述机制就是时间的问题了。比如看到了对肿瘤细胞增殖的抑制（Ki67染色）、诱导细胞凋亡（剪切的caspase-3染色）后来发现起到关键作用的就是mTOR下游的效应分子p-4EBP1，也揭示了为何mTOR的抑制剂rapamycin为何不能完全抑制其活性，虽说对mTOR下游的pS6RP的抑制明显，可是对p-4EBP1的抑制确实短时间的。

可是新的问题出现了，不是所有的PDX小鼠的脑转移的乳腺癌都能被治愈，其中两个还是没能挺过来。作者没有放弃，而是深入探究了原因，利用全外显子测序（whole-exome seq，WES）的方法分析所构建的5个PDX小鼠肿瘤细胞。一般来说，体内的肿瘤发生非同义替换的突变几率~7-8 mts/Mb，HER2阳性的乳腺癌中~10 mts/Mb，而文中对药物不敏感的癌细胞高达60-70 mts/Mb，并且许多关于DNA修复的基因发生了突变，如碱基切除修复（Base excision repair, BER）、核苷酸切除修复（Nucleotide excision repair, NER）、错配修复（Mismach repair, MMR）、双链断裂修复（double strand break repair, DSBR）等等（可参考DNA repair (I)和DNA repair (II)）。

（From Jing Ni et al., Nat. Med., 2016）

报告中Jean还介绍了另一个重要的发现，也算是否极泰来的结果，等到文章刊登出来再作介绍吧，一个关于PI3K isoforms的选择性抑制剂的的模型，值得期待。在听取报告之前，随意下了几篇与之相关的文章，对Cell这种文章想浏览也很难，里面太多的细节、内容很广泛。听了Jean的报告才发现，原来可以更简单的浏览：曾经需要了解文章中每个字的含义，后来只需大概知道实验做了哪些，再后来就直接看每段话的结尾，接着看结果图也能掌握大概，再后来看看摘要就知道是否值得阅读，现在看来需要先看看标题，而且是系统的浏览相关论文的标题，还有课题组的简介，可是终究不如亲身现场听作者前后梳理，看着精美的动画和关键的结果，有时真的会让自己“哦——原来如此！”。

虽说我很想知道她们做一个PDX模型需要多久、多少人力，也想知道她是从何时开始的，博士期间做了什么，是什么让她对科研如此的感兴趣，最终我也只能默默的思考一下了。可是她在讲解的过程中，总能感受到她对科研拿捏自如，俨然已是专家中的专家，这需要时间，需要经历。那么她为何选择PI3K？为何会细致的做到这个家族中的4个isoforms？其分子调控机制为何至今才被揭示？这离不开Jean的团队建立的PDX模型。

有了新的靶点，新的机制，我想日后会有许多人关注PI3K家族各个成员的特异性的小分子抑制剂。可以再看看这个家族有哪些成员？有何区别？如何分类？在癌症各有何作用？在疾病治疗中有何影响？耐药机制有哪些？如何联合治疗？

（休息片刻，未完，待续……）

TJ Pharmaron

2016年7月2日星期六