A story of MCF-7

看到新鲜的东西，我总是不愿意停下，真想一口气把她查阅一个遍，可问题总是越查越多，越发让我觉得阅读英文文献的速度如蜗牛啊，没有办法，有时只能适可而止，还要看工作之余是否有时间深究，日后若有先关项目再深入也不迟。这回想跟着MCF-7这株癌细胞系的线索随便谈谈，之所以感兴趣，多少与自己曾经接触有些关系，再把几个分散的小点拼凑在一起，有种豁然开朗，相知恨晚的感觉，比较爽！

起初听到MCF-7是在研究生阶段的实验室，有医学院的同学多次使用这个细胞，在实验室库存中的诸多细胞株中也包括这株，当时只是重复多次念叨这个名字，希望自己能多接触一些细胞，后来发现细胞株如星星一般多的让你数不过来，后来感觉需要知道对于一个实验如何选择细胞、如何培养、如何分析即可，现在发现每一株细胞背后都有很多故事值得探究，比如五十多年前George Gey从宫颈癌患者Henrietta Lacks体内分离的一株细胞系（就是至今还被人们广泛应用的HeLa），为药物研发和科学研究带来许多便利；比如1958年人们从乳腺癌分离出的第一株细胞系BT-20（Lasfargues EY, Ozzello L. J Natl Cancer Inst 1958），但那个时候的应用还不是很广泛，不过二十年后分离癌细胞株的技术渐渐走入公众视野，其中就包括MD Anderson系列（Cailleau R etc., In Vitro, 1978）和MCF-7（1973 at Michigan Cancer Foundation，如今是Barbara Ann KarmanosCancer Institute，Soule HD etc., J Natl Cancer Inst,1973）。后来我才发现为何MCF-7如此流行，因为她的表面带有雌激素受体（estrogen receptor，ER）、雄性激素受体（progesterone receptor，PR），是一类用于研究激素体内调节、自分泌时非常合适的细胞模型，经常用于筛选小分子化合物类的药物。

偶然看到一篇缅怀性的文章（Cancer Res-1997-Levenson），为了纪念当年分离到MCF-7细胞的Dr. Herbert Soule。自Herbert分离到这株细胞后的数十年，人们对细胞复制和雌激素相关信号通路的转导有了新的认识，直到后来这株细胞被广泛的应用于的药物的R&D。对如何发现新的治疗靶点（therapeutic targets）、她们一般具有哪些特点、以往成功的靶点主要有哪几类等等问题我是很感兴趣的，一直期待着有人能总结一下先关内容，好好学习一番，可感觉还是先要靠自己的努力，多交流，多思考，多浏览。

MCF-7分离自一位69岁的恶性乳腺癌患者的胸膜积液（pleural effusion），她曾因患有乳腺癌做过切除手术。Soule的文章中提到患者在术前接受了放射性化学疗法和激素治疗，在Tamoxifen未问世之前，患者主要接受的是高剂量的合成雌激素乙烯雌酚（diethylstilbestrol），那时人们已经发现这种疾病主要受激素的调节。但事实并非完全如人们所愿，各地患者出现了反弹的迹象，也是在这个时候，很多人又开始研究该疾病的复发机理，其中最为重要的发现来自和Dr. Soule共事的Dr. Sam Brooks：他在MCF-7细胞中发现了ER（SamBrooks etc., J Bio Chem, 1973）。这个发现加速了人们在该领域的探索，几年后Dr.Marc Lippman等人发现Tamoxifen可以抑制MCF-7的生长，该作用可被雌激素抵消，由此她被称为雌激素竞争性抑制剂（competitive inhibitor）。Wait a minute，如果这个发现放到现在，你会如何向下走？会关注哪些方向？又会联想到什么？这些发现或事件到如今还广泛受人们关注，或许是由于乳腺癌患者数目巨增，癌细胞的也产生多样的抗性，可以说癌细胞和药物在相互选择、进化，这也就是说曾经的科学研究会再次浮出水面，只是利用的技术和手段发生些变化罢了（发生了哪些变化？因为什么？）。

Tamoxifen

关于Tamoxifen，在Wiki也有着很有趣的故事，主要有两本书介绍相关事件：Estrogen Action, SelectiveEstrogen Receptor Modulators and Women's Health (Imperial College Press 2013)和TamoxifenPioneering Medicine in Breast Cancer (Springer 2013)。早在1950s就有公司（ICI Pharmaceuticals）研究避孕的药物（contraceptive pills）。1966年由Dora Richardson首次合成Tamoxifen，当时受相关专利保护，直到1980s被美国专利局拒绝，原因是没有数据直接显示该化合物与避孕相关。其是当时人们已经知道乳腺癌和雌激素密切相关，只是当时关于癌症治疗的研究手段并不多，并没有能力详细的阐明该分子与雌激素的关系。后来Dr. Judah Folkman发现Tamoxifen对新血管的发生有抑制效应（在那之前他发现新血管的生成和癌症的发生有密切关系，为此还给癌症的治疗带来新方向）。到九十年代有一种混合疗法进入临床（celecoxib, doxycycline和tamoxifen，后来被称之为Navy Protocol）（By Kirk E, Health andBehavior. USA Today, 2002-07-24），后续的研究发现tamoxifen独自也会抑制肿瘤出血管的发生，不过并非依赖于她抑制ER这条通路。关键的事件还是在临床的研究中看到tamoxifen对乳腺癌早期的患者有明显的治疗作用，尤其是ER阳性的患者。记得曾经查阅过HER2阳性的、PR阳性的乳腺癌，现在综合起来看，原来人们早已将此归纳分类，仅仅由此三个受体就可大致将乳腺癌分为五类：luminal A, luminal B, HER2, basal and normal（Perou CM etc., PNAS, 1999）。

（From Deborah L Holliday and Valerie Speirs, Hollidayand Speirs Breast Cancer Research 2011, 13:215）

言归正传，回到MCF-7。她之所以如此“出名”得益于她外表的一些标签，是一些逐渐被人们发现的标签。Dr. Bill McGuire实验室的博士研究生Kathryn Horwitz在毕业时发现MCF-7表面表达了很多非常有用的受体：糖皮质激素受体（glucocorticoidsreceptor, GR）、孕激素受体（progestins/progesterone receptor,PR）、雄激素受体（androgens receptor，AR）和ER。现在感觉这株细胞就是集大佬于一身啊！正好用于研究激素调节的相关疾病，所以Kathryn在文章的结论中提到“MCF-7细胞是在体外研究内分泌在肿瘤发生中的作用非常合适的模型，还可用于研究复杂的激素相关的信号通路”。

不过话虽如此，多数的研究还是集中在ER这个靶点上，或许是由于乳腺癌主要受estrogen的影响吧，ER也就成为了众人瞩目的名人中的明星。早期的同位素标记实验显示了estrogen会刺激细胞增殖，但其他方法却未能观测到此现象。由此人们怀疑estrogen的刺激作用是直接的？还是间接的？（为何会如此想？）直到后来有课题组发现她在体外不能刺激MCF-7细胞的增殖，却能在体内观测到这种刺激作用，于是有人猜测这个过程或许需要一个第二信使（体内可以提供，而体外却不可）。当时这种猜测也不是没有根据的，因为那时人们发现在大鼠体内由致癌物质诱发肿瘤的发生同时需要estrogen和estrogen刺激后产生的催乳素（estrogen-stimulated prolactin）。不久后有人在缺失胸腺的小鼠（裸鼠）内观测到estrogen可直接刺激MCF-7细胞在增殖，表明通过第二信使发挥作用的说法不大可能。其实，人们被迷惑了很久！后来人们发现他们一直应用的细胞培养基中本身就含有estrogen，如此一来，补加estrogen也就无法观测到进一步的增殖作用。可是，如果细胞培养基中没有她，人们也就不会发现MCF-7这株细胞了，因为她根本无法培养。是否有人想知道这是如何发现的呢？那时人们为了研究ER，希望利用一种荧光标记的方法标记estrogen，这样就可以显示ER所在的地方和含量（这不就是间接的免疫荧光嘛！利用配体和受体的结合，后来是抗体和抗原的结合，应用更广泛了而已），又一次忘记弃除培养基，才发现培养基中有化学物质同样可以被标记。随即人们想到了培养基中微摩级的酚红（Phenol Red），这是一个与estrogen结构类似的物质，后来有实验显示出去酚红的培养基中的MCF-7更容易相应estrogen的刺激效应。（可能这就是有些实验中需要无酚红培养基的原因吧）

发现细胞培养基中含有estrogen固然重要，后来研制出ER的单抗在乳腺癌的治疗中则更为重要，暂时不提单抗的发现对整个免疫学的震动，人们利用此单抗可以研究ER在细胞亚水平的角色，比如定位如何、转运方式等等，原始模型认为ER在细胞质中，与estrogen结合后转运到细胞核内，可是1997年Zava和McGuire利用一种精细的方法分离细胞中各个亚组分，显示ER平时也是停留在细胞核内。然而，直到廿年后数个课题组独立地利用无破坏性的方法观测到ER定位在细胞的核内，这个发现改变了人们以往的概念，所用的细胞依旧是MCF-7。更如是，人们利用单抗标记技术发现了ER在estrogen和estrogen抑制剂影响下的动力学变化（这项技术沿用至今）。很容易想到，有人研究ER，就会有人研究其他的核受体（nuclear receptor）。写到这里不禁让我想起曾经的领导Dr. Chang Bai，和他交谈的过程中才知道他也曾在这片领域中做出辉煌的成就，只是目前我还没有找到他发表的文章，不知他发现了哪个受体还是研制出一种非常有潜能的抑制剂。在入职时还能听到HR对这位领导的介绍，曾经有若干个研制的药物走进临床。时过境迁，要不了多久又会看到他的药物进入临床，值得期待！

其实在MCF-7之外，T-47D和MDA-MB-231两株乳腺癌细胞系应用也非常广泛。只是MCF-7在历史中的作用是不可否认的，因为她，人们又一次向前迈一步：克隆并测序ER基因。这时人们才知道ER横跨>140kb的DNA序列，分为8个外显子，RNA长6322 bp，编码595个氨基酸的蛋白质，从此人们对ER的研究进入分子生物学阶段。通过（点）突变定位她的功能区和多样性，还可以细致的研究ER相关的信号通路、转录激活、靶基因等等，这是一个好时候，很多新发现从这里起航。关键的一点在于1970s，人们发现了ER的正向调节和负调节的生长因子。还是Lippman的课题组，他们长时间专注于激素对TGF-α/EGFR系统的影响，可是他们选用的MCF-7细胞不是很合适，因为她自身受激素调节，表达的EGFR和分泌的EGF也很少，不像其他激素非依赖型的细胞会表达很多EGFR在表面。不过，他们在裸鼠中观测到MCF-7自身分泌的因子可以促进其增殖，可在体外却未能重复出相似结果，转染TGF-α的cDNA也无济于事，可是转染v-ras^H却能弥补。此外，还有人研究MCF-7中胰岛素（insulin）和IGFs（insulin-like growth factors）对estrogen诱导乳腺癌细胞增殖的影响。（看到这里就理解为何有人喜欢在培养MCF-7的时候加入insulin了）

（From Anait S. Levenson andV. Craig Jordan, Cancer Res, 1997）

大概一个世纪以前，人们就注意到乳腺癌在清楚estrogen时存在复发的情况，或许是在自然选择的情况下产生一些突变型的细胞，他们的生长不在依赖激素的调节。由此，曾有人们利用MCF-7细胞筛选estrogen抑制剂耐受的细胞系，比较多株细胞系后人们确定了一种野生型的ER（话说野生型和突变型也是相对而言，如何界定呢？估计要花一番功夫，不像如今可以利用数据库比对分析，当时的样本量和序列的比对一定非常的艰难）。利用无estrogen的细胞培养人们获得了许多可以生长的MCF-7，随之而来的就是诸多的突变型（这种发现有点类似CRISPR的早期事件哈，长期培养后一些细菌可以抵抗噬菌体的侵染）。免疫缺陷的小鼠也为人们研究乳腺癌提供了很好的体内模型，而推动此模型的又是MCF-7，她们在切除卵巢的裸鼠中的增殖需要estrogen。值得一提的是，MCF-7不会疯狂的增殖，因为这类小鼠的内分泌功能缺乏且没有发情期（estrouscycle） ，此时estrogen的补充是必须的。原来早期Tamoxifen被认为是小鼠体内的“estrogen”，但他不支持MCF-7在体内的增殖，相反，他会抑制estrogen对MCF-7的刺激作用，这与体外的发现时一致的，这里面有很多故事就不在此赘述了。

话说有MCF-7，一定有其他的同伴，她们有什么作用呢？有和区别呢？不过这不是我感兴趣的地方了，这株细胞让我很想知道乳腺癌的研究进展和历史，想知道人们是如何一步一步挖掘这类疾病，如何解决的，又遇到哪些问题，又是如果改变策略，目前国内外的研究形势怎样。我就好比一个门外汉，很想推开这扇门瞧瞧里面是什么样子。

未完，待续……

TJ  Pharmaron

2016年6月14日星期二