Mitochondria (II)

有一篇文章放在书桌已经很久，一直没有时间看，名为“Mitochondria: A Historical Review”（by LarsErnster and Gottfried Schatz，1981, J. Cell biology,91,3:227s-225s），她吸引我的地方是1981年的综述过去百年研究的总结（其实主要还是二战后的研究）。我想知道正直中国被世界蹂躏的时候西方的国家都在关注线粒体（Mt）的哪些故事，在人们未知DNA为何物时，科学家是如何挖掘这个特殊的细胞器？科学的世界里也有很多不纯正的味道，但是听着科研的故事，可以省去人为的不确定因素，只有对真理和世界的探索、求知。

Mt的发现，震动了细胞生物学、生物化学、生理学、分子生物学等领域的研究。试想，如果你处于当时的年代，第一时间得知原来这就是Mt，作何感受？估计不会像如今这样针对新的发现如此过度的反应，让人觉得真有些浮躁，不像是做科学的人该有的反应。越是关注的人们，越是抓紧时间着手研究，而不是急于议论和评论。不过这也从侧面反应了公众对科学的关注度明显高于以前了，是好事！Mt促使人们深入寻找新的亚细胞结构，氧化呼吸链更是让生化学家爱不释手，急于搞清楚其分子机制，生理学者也从新审视了物质转运、代谢等调控机制，分子生物学家看到mtDNA及其指导合成的蛋白质开拓了一篇新的基因调控的领域。

The beginning

对Mt最早的描述可追溯到1840s（这个时候中国发生了什么？哎！），在人们发现细胞核之后不久，不过Mt首次被发现广泛存在细胞中时已经是1890年。Altmann将其称为“Bioblast”描述，认为她们是生活在细胞内部并且具有重要功能的基本的生物体（后来确实有人认为Mt来源于细菌，因为二者有太多的共性）。到1898年，Benda将其更名为“mitochondrion”，取自希腊语“mitos”（线性）和“chondros”（粒状）之意。1900年Michaelis发现氧化还原反应（redox）染料Janus Green B（又一次出现Janus，估计源于“氧化和还原”这种对立反应）可特异的识别Mt（Michaelis, L. 1900. Arch. Mikrosk. Anal. 55 :558-575），在1952年人们得到Mt的电镜照片之前这种染色方法被广泛使用，被称为“official portrait”（金标准）。可惜当时Michaelis关注氧化还原反应却没能与Mt联系起来，要不然也不至于在五十年以后Lazarow和Cooperstein揭示了Janus Green B被Mt中的细胞色素酶（cytochrome）氧化的机制（Lazarow, A., and S. J. Cooperstein. 1953. J. Histochem. Cylochem.1:234-241）。自1934年人们从豚鼠的肝脏中分离到Mt后，开启了人们细致研究Mt亚组分的大门，关于呼吸链的报道也随之而来。

起初自己还在想为何“细胞可以呼吸？”现在觉着应该是这个过程需要O₂。如今我们已经知道了糖酵解和三羧酸循环的过程，殊不知在如此复杂的过程历经许多代科学家的不懈努力。1910s的研究显示使染料发生还原反应的脱氢酶（Dehydrogenase）存在于一种不可溶的细胞结构中，1913年Warberg等人报道了在豚鼠的肝细胞中与呼吸相关的一种颗粒，他们称之为“grana”，并提出这种颗粒的结构为了增强某种含有离子的呼吸酶（ion-containingrespiratory enzymes）的活性。当时人们关注两个方向：Warberg的氧原子转移和Wieland的氢原子转移，但他们都认为这种颗粒结构以某种方式增大了反应发生的表面积，为此也提出过两种模型（Charcoal model and platinum model）。

直到1925年Keilin发现细胞色素酶，再一次吸引科学家的关注。由此，人们渐渐的知道呼吸链里的主要成份。其中重要的发现包括1937年Krebs发现的“citricacid cycle”和Kalckar描述的有氧磷酸化（aerobicphosphorylation），1939年Belitser等人发现每消耗一个氧原子可合成2个ATP分子等等，这些发现让人们想到了这种磷酸化反应可能与氧化的过程是偶联的（Big Step）。这样的猜想在1948-1949年间得到了证实，Friedkin和Lehninger用体外实验检测到了这种偶联过程，与此同时，Green等人也得到了同样的结果（在此期间人们也首次对脂肪酸的氧化有了深入的了解）。

A diagram of cellular respiration including glycolysis, Krebs cycle (AKAcitric acid cycle), and the electron transport chain

（By RegisFrey）

Structure-FunctionRelationships

应该说对Mt的研究有直接促进作用的事件是Mt的分离。在1930s期间，人们对细胞的亚组分研究更为细致，直接研究细胞水平已经无法满足人们的好奇心（或者说许多问题不能仅仅在细胞层面获得答案）。Claude研究Mt许多年，获得了基石性的研究工作和成果，并且构思出许多规则。试想，放在当下，我们是否有能力独立探索出一条分离Mt的方法？这就是科学的魅力，你可以依靠前辈的研究成果，开拓新的发现。Claude当时大致获得了细胞的四个组分：一个是比重较大的部分（细胞核和细胞碎片），一个中间部分，颗粒较大（也就是Mt），一些由较轻的、更细微的颗粒构成（他称之为微粒体，microsome），还有可溶解的部分（包含细胞液）。还记得在研究生阶段老师教我们分离叶绿体，现在看似简单的方法，在起初的探索中是充斥着诸多未知的，需要多层次、多手段的确认我们分离到的到底是什么，有什么功能，纯度如何？要知道，在未知的时候，稍微有一些污染也是“致命的”，就好比DNA发现的过程中有人认为“DNA中污染了一些蛋白质，无法排除蛋白质是遗传物质的可能”。

1949年Kennedy和Lehninger报道了耗氧的三羧酸循环和脂肪酸氧化，利用分离出的Mt证实了氧化磷酸化的偶联过程。后面更细致的研究发现NADH并不能穿透Mt，而是在Mt的外部发挥功能，加入cytochromec的时候，NADH会发生非磷酸化的氧化过程（后续的实验显示这个过程和磷酸化氧化的过程不同）。人们对三羧酸循环、脂肪酸氧化、细胞呼吸、磷酸化的了解有了新的高度，在此期间，还有很多人关注着各个过程中的关键成员——酶，比如腺苷酸激酶（adenylate kinase）、谷氨酸脱氢酶（glutamatedehydrogenase）、转氨酶（transaminase）、丙酮酸羧化酶（pyruvate carboxylase）、核苷酸二磷酸激酶（nucleoside diphosphokinase）等等（这些曾经不了解的生化消息，容易混淆的概念，现在看起来仅仅是个名称和反应而已，当年之所以学不好，估计是对这一连串的名字不敏感，也就是基础不牢固）。其中一个重要的发现时人们发现Mt内的酶也存在于微粒体部分和细胞液部分（要记得，当时人们对细胞的亚结构还不清楚），有人就怀疑这些酶真的有两个货多个定位的位置？还是分离手法并非完美？在解决这个问题，人们又发现了一些“标记酶（marker enzymes）”，也因此发现了新的细胞器（溶酶体，lysosome）。饱受争议的是NADP偶联的异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase），后续的研究显示这个酶的在细胞中的作用离不开线粒体。

下一个关键的发现是伴随技术而生的——电镜和双层膜结构。一种先入为主的思想已经夺取了我思考的过程，当时怎么就没有这样的疑问：什么是双层膜？如何的双层？为何如此？有何功能？当时的我不知道如何提出问题，当然也就不知道如何学习新的知识。当人们看到这张电镜图时，也很激动！Palade等人据此结构推测出Mt的双层膜结构模型，并提出内膜和外膜之间围成的空间或腔室（spaces or chambers），几年过后被人们广泛的接受。看到第一张照片后，人们观测了其他细胞、其他物种内的Mt，随之提出了多样性的说法。Mt的形状、大小、分布并不尽相同，并且有人提出Mt具有高度动力学的结构：她们的形状和体积会变化。

早在1950s，Mt的电子转移系统和氧化磷酸化就是最受关注的地方之一，对如此细节的理解需要很深的生化功底，在此就不班门弄斧了，但我能感受到当时也有许多疑问急需解决，在解析ATP合成的过程需要解释清楚任何一个关联的步骤，这个网络结构在那个时候是比非常具有挑战性的。只是这个时候有个更重要的发现更能吸引人们的眼光——DNA的双螺旋结构问世了！随后Mt自身合成的蛋白质、携带的遗传物质、特异基因等发现被接连报道。

粗略的看一下1980年前关于Mt的故事，这才发现，在我出生之前许多年，人们所知道的知识要远远多于我如今所能接触的知识。在那以后，Mt的研究更为深入、广泛，这也得益于生物科学的快速发展和技术的日新月异，现在我们可以说某些人是Mt expert，真是时也，势也。不到一代人的时间，人们对生命的认识可以达到如此地步，不知日后一代人的时间会有如何惊人的发现？面对最为创新的发现，其实只是那一小戳人的成果，但人们开发和拓展的能力是惊人的。就好比前不久的CRISPR/Cas9和如今的NgAgo-gDNA，这在三十年前，估计人们也只能“科幻”一下，如今已经成为现实，时间会证明哪一个的应用更为广泛。还有这几天BBC报道的几条国内的重大科研项目，让我这种脱离科研很久的人感觉时代走的好快，我好想如何也追赶不上了。

TJ 泰河园

2016年5月24日星期二