Mitochondria toxicity (I)

看着细胞结构示意图，让我回想起很多即将被遗忘的高中知识，现在未必能绘制出每一个部件。由于近期陆续承担若干个关于线粒体（mitochondrion, Mt, pluralmitochondria）的项目，很想多了解一番这个被称为能量工厂（powerhouse of thecell）的细胞器到底是什么样子，也想知道她在药物研发中的作用。

Diagram of a typical animal cell（By Kelvinsong）

1, Nucleolus; 2, Nucleus; 3, Ribosomes (dots on rough reticulum walls);4,Vesicle; 5, Rough endoplasmic reticulum; 6, Golgi apparatus (or "Golgibody"); 7, Cytoskeleton; 8, Smooth endoplasmic reticulum; 9, Mitochondrion;10, Vacuole; 11, Cytosol; 12, Lysosome; 13,Centriole; 14, Cell membrane

Mt，也就是线状的、成粒的小体，看着名字就能知道他复杂的结构和独立的功能（什么样的物体又能线状和粒状？DNA那样复杂的盘绕是否也算？）。本身带有双层膜结构，内膜褶皱的结构被称为脊（cristae），ATP的合成就是在这上面完成的。Mt存在与大多数真核细胞内，但数目不同，比如红细胞（red blood cells，RBC）中没有Mt（其实他们也没有核，也就是没有DNA，也就是不能复制和扩增，所以RBC也被称为红血球），而肝细胞中多达2000个。Mt中有独自的DNA（mtDNA，听说和细菌的基因组同源性较高），蛋白质组学的数据显示人类细胞的Mt中已发现615个不同的特异性的蛋白，包括氧化磷酸化的蛋白，这些蛋白呈现出一种动力学的平衡。现在看来她真的很特别，就这两层膜的结构在细胞中就独一无二了吧？特殊的脊和小肠内壁类似，是为了功能而存在的，有很多报道显示她们与细胞凋亡、Ca²⁺信号通路、细胞代谢的调节、增殖、血红素和固醇类物质的合成等过程密切相关。

（By Kelvinsong, modified by Sowlos）

我想能量转换的过程（Energy conversion）是最为关键的，也就是合成ATP，为需要能量的过程提供能量，重要性不亚于相对于汽车而言的汽油。试着再看一看，好像从来就没有完整的记得过，哪怕是考研那会儿。其中有五个定位在内膜上的复合体（complexes I to V）负责氧化磷酸化（电子转移链）和ATP的合成，这个过程中主要氧化细胞质中产生的葡萄糖、丙酮酸和NADH。氧化开始时NADH在复合体I（NADH ubiquinone oxidoreductase）中转移到CoQ（辅酶Q，也就是ubiquinone），Succinate的电子在复合体II（succinate dehydrogenase）中通过FAD（flavin adenine dinucleotide）将电子同样转移到CoQ，再进入复合体III（ubiquinolcytochrome c oxidoreductase），看到这里还不能休息，还要继续追踪电子的足迹，有种让人紧张又压抑的感觉，好像这条链是个整体，绝对不能够断开，否则对Mt和细胞而言表现出的就是毒性。好吧，继续！复合体中的细胞色素c（cytochrome c, cyt c）接过电子继续向前冲，来到复合体IV（cytochrome c oxidase）在这里电子终于遇到了氧气，被氧化后形成H₂O。看起来好像是电子是主角，其实这里面有暗度陈仓的“特工部队”，也就是H⁺，所谓的还原氢。如果不注意最眼花缭乱的部分，你会发现在Mt的内膜两侧的H⁺只出不进，不断的积累在内膜空间，最终也就造成了内膜内里外的浓度差、或电位差、或pH差、或者说势能差，有积累已久的能量，就有产生新鲜事物的能力，就这样大量的H⁺通过复合体V（ATP sythase）产生大量的ATP。这个过程涉及到电子的转移和ADP磷酸化的过程，故被称之为氧化磷酸化。

Diagram of the electron transport chain in the mitonchondrial intermembranespace

（by T-Fork）

呼！还是那句话，先不要太注重里面的细节，只是诸多拗口的名字就让人头疼了。现在有种怪异的感觉：学习新知识的时候没有基础反而会有帮助，或者说忘记曾经拥有的不完整、不系统的知识，从新的视角重新审视貌似熟悉的内容，会有不一样的收获。

化合物诱导Mt毒性的机制有很多，比如抑制了上述过程中的复合体活性、诱导H⁺以其他方式流回内膜、抑制Mt膜上的转运蛋白、抑制Krebs cycle、抑制mtDNA复制、抑制Mt蛋白的合成、影响氧化压力等，在药物研发的过程中不断发现对Mt有毒性的药物，基础研究中对Mt的功能有的更多新的发现，这也是近十年来人们如此关注Mt的原因之一吧。

Strategies to reduce late-stage drug attrition due to mitochondrial（By Dykens JA et al.）

看到一篇Cyprotex公司的一篇Guide，介绍了许多细胞毒性相关的理论和实验，其中提到有许多方法可分析药物Mt的毒性，仅次于DDI被放到第二条，可简单看看。

分析Mt产生ATP的能力。许多体外培养的细胞在高糖的培养基中多数是在缺氧或厌氧的条件下生长，因为此时细胞会利用高浓度的葡萄糖（Glucose）以糖酵解（glycolysis）的方式产生ATP，而不是氧化磷酸化（这种效应被称为反巴斯德效应Crabtree effect），这样会降低Mt对药物的敏感性。如果此时将葡萄糖换成半乳糖（Galactose）即会增加Mt主导的ATP合成，分析在两种不同培养基中细胞产生ATP的水平，可间接的分析药物对Mt活性的影响。（Marroquin LD et al. 2007, ToxicolSci 97(2); 539-547）

分析Mt的膜电位。这个应用依据的是Nernst equation，在电化学中，用来计算电极上相对于标准电势（E0）来说的指定氧化还原对的平衡电压(E)，能斯特方程只能在氧化还原对中两种物质同时存在时才有意义，而Mt在传递电子的时候，就已经造成了内膜内外的H⁺浓度差。目前市面上有一些染料如TMRM（tetramethylrhodamine methyl ester）、JC1、rhodamine 123 and Mitotracker Red等，可以指示Mt的膜电位。这种方法能分析药物对Mt转运H⁺的能力，所以难以区分药物是对Mt氧化能力的影响，还是对H⁺转运的作用。也可利用染色的方法分析Mt的数量。貌似在细胞亟需能量的时候，会增加细胞内Mt的数量（好像某种获得性效应），若是药物对Mt有损伤，那么也会影响Mt的增殖，可以通过Mt特异的染料Mitotracker®Green FM 和NAO（10-N-nonyl-acridineorange chloride）检测药物对该过程的抑制。（Agnello M et al., 2008, Cytotechnology 56(3);145–149）还可以检测细胞对氧气的消耗量和细胞外的酸化。有一种感应分子可以通过荧光的手段检测细胞对氧气的消耗（By Luxcel Biosciences Ltd and Seahorse Bioscience）。

分析Mt特异的基因和蛋白水平。这种分子手段更直接的显示细胞线粒体的活性或数量，MitosciencesInc（如今被Abcam plc收购）在2007年曾建立一种方法，可以在体外分别分析Mt电子传递链中的四个复合体（I，II，IV和V）的活性，适合HTS，结果也很漂亮（Nadanaciva S et al., 2007,Toxicol In Vitro 21; 901-911）。分析Mt的蛋白和基因需要一段时间（1~2 w），因为mtDNA和13个相关的蛋白的turn over速率比较慢。一种利用高内涵（high content imaging）的技术已经比较成熟，可以直接检测真核细胞中Mt蛋白的量。当然，也可以利用LC/MS的技术分析Mt对一些特异底物的代谢情况，比如SIDMAP（stable isotope-based dynamic metabolic profiling），可以指示乳酸的合成、Krebs cycle和脂肪酸氧化等。

之所以已经有了很多方法来研究Mt，这就说明她在药物研发中已经有了一席之地，不妨在多看看有哪些疾病和Mt相关？有哪些targets？如今人们的研究方向主要有哪些？日后的前景如何？是否需要持续关注？等等，早在研究生阶段南开大学生科院的陈佺教授多年从事线粒体研究（科班出身），不知他是否发现了Mt与Parkinson疾病的关系。稍微搜索一番就能感觉到Mt的研究不亚于对细胞的研究，虽说她仅仅是细胞里的一个细胞器，特别的功能给了他特别的意义。

有人说Mt是生命的能量之源，同时也是一把双刃剑，随时可能成为摧毁自我的武器，因为人们发现许多致死信号转到与其相关。冲着这一点，就有很多团队希望能够通过靶向Mt治疗癌症，通过激活致死通路诱导癌细胞的死亡，比如提高Mt外膜的通透性，释放一些诱导Apoptosis和Necroptosis的信号，比如影响细胞的ROS（reactive oxygen species），再比如影响呼吸链等等，同时她的危险也在于自身的突变常常诱发癌症（如乳腺癌、前列腺癌、甲状腺癌等）。

Mitochondrial permeability transition (MPT)

permeability transition pore complex (PTPC), voltage-dependent anionchannel (VDAC), cyclophilin D (CYPD), mitochondrial transmembrane potential(Δψm), B-cell lymphoma protein 2 (BCL-2), solute carriers (SLCs), peripheralbenzodiazepine receptor (PBR), hexokinase (HK), BCL-2-associated X protein(BAX), mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP), intermembranespace (IMS).

Simone Fulda等人在2010年曾经介绍了靶向Mt的药物（可参考综述Nature Reviews Drug Discovery 9, 447-464），主要包括她的膜通透性、膜转运和代谢过程。这里面有我们经常能看到的bcl-2（B-cell lymphoma protein 2）活性调节、代谢抑制剂、电压依赖的离子通道抑制剂、ROS调节、Hsp90（heat-shockprotein 90）抑制剂等等，还详细介绍了药物靶向Mt的方法和体外实验方法等技术内容。对我而言，里面许多内容过于陌生，还无法融会贯通，到时让我有兴趣深入看一看Mt的相关研究，查查人们是如何一步一步揭示如此复杂机制的历程。

TJ  Pharmaron

2016年5月6日星期五

Ps. 我好像习惯了在实验空挡的时间阅读我不了解的内容，不知不觉自己敲打过的文字超过200,000。今天Y. X师姐对我说“无用之事才是真爱”，不知是不是巧合，有些同感。近期看了近代的十多个人物的传记，发现在和平年代“启蒙思想家”要绝迹了，人们不在追求自己的真爱，一切举动围绕现实，围绕如何生存，却忽略了内心或精神的世界。在我这个狭小的圈子里，确实遇到一位以兴趣为工作的朋友，我知道他高中的时候就喜欢鱼，他的奶奶在他小时候的时候就介绍许多鱼给他，如今他有自己的鱼馆，可以专业的传播鱼文化，这是让我非常羡慕和钦佩的！我至今还没有发现自己到底喜欢什么，眼前必须要保证能够生存，不过我依然希望早日能遇到值得我奋斗终身的工作或生活。