A story of CAR-T (I)

借着午休的时间稍稍整理一下关于CAR-T的故事，早在去年九月份的时候参加一次论坛（记北京国青论坛），首次听到周鹏辉教授讲解CAR-T是什么，能做什么，当时的进展及未来可能发生什么，他的报告做的很好，守时；内容清晰，PPT的动画让我能跟上他的步伐；语言简明、易懂，当时便勾起了我对CAR-T的兴趣。因为鄙人觉得免疫相关的知识和技术都是高大上，本科时院长徐安龙教授曾给我们讲免疫学，当时实在是跟不上他讲解的英文原版书，自那以后我就很少接触免疫学了。直到研究生时，又遇到一位做免疫的院长，尹之南教授。渐渐的听到院里更多关于免疫的报告，对基本的概念有一点了解，不过还是过于肤浅。这也是我下决心搜索一下最前沿研究的动力，我不知道什么，我越是要搞清楚她是什么。

就这样，开始了数月前的故事。

去年十月份的时候，公司的同事Linhu Ge给我们讲述了免疫组织、免疫细胞及一些免疫机制。非常的清晰，把我许多的疑问都能解释清楚，这些基本的概念融合在一起，对我而言，就是免疫系统。正是如此，我才有可能于十一月初在部门内再做一次简单的Journal Club，与大家分享我对CAR-T的了解。半个月以后，我听到CRISPR/Cas9的基因编辑技术（杂记 ● 关于CRISPR），当时我满怀憧憬的写下：what if: CAR-T & CRISPR?如今看来，原来那是可行的，而且竟然如此火热。我不得不告诉自己：有时需要记录自己突然的想法，近期的直觉有许多是可行的。在实验中也多次遇到类似的情况，要相信自己的直觉，虽说当时听起来不怎么靠谱。

简单来说正常体细胞基因组发生突变后，有些细胞会转变成癌细胞（就是无法控制生长而快速繁殖的细胞），有些癌细胞会分一些正常细胞所不能分泌的底物或物质（相对正常的机体而言就是抗原），当抗原递呈细胞（APC, antigen presenting cell）发现异情后便会尽快将此抗原捕获并送达到T细胞的“大营”（淋巴结等淋巴器官）并通过信号传递报告给T细胞。（后来我才知道T细胞的活化需要两个信号，一个来自MHC分子和TCR的结合，一个来自B7分子和CD28分子的结合。）T细胞被激活以后，开始活化、大量扩增（此时他们已经记得抗原的部分结构），进入血液循环系统，开始在整个机体范围内搜寻异常的癌细胞。他们凭借不间断的分子信号、细胞因子等，寻觅到异常的组织或细胞，透过血管、层层组织，终于到达癌细胞的本营，通过分子对接后再次确认那些癌细胞就是异常的细胞，便开始发挥功能：清除癌细胞。

发现如此简单的循环，经历了数十年、太多科学家的努力，我只能说太多细节我还不清楚，只能在此向伟大的科学家们致敬！是他们不懈的努力才让如今的人们更加了解免疫系统是如何运作的。

喜欢问问题的人就会发现上述的过程中存在诸多的疑问：比如那些分泌的抗原是什么？T细胞如何识别？是否一样存在“Off-Target”效应？T细胞如何侵入癌细胞的中心？T细胞如何杀伤癌细胞、效率如何？癌细胞是否存在逃逸的机制？整体看来，T细胞并不能自发的完全清楚癌细胞，要不然如今癌症也不会是第二号杀手（貌似头号杀手是心血管疾病）。那么如何提高T细胞的效用，就是研究的一个方向了。

先让我们简单看看T细胞发挥作用的方式有哪些（参考Lei W.,et al. 2014, Int. J.Cancer）：

这篇文章中简单描述几种常见的方式：

(a)抗体介导。单克隆抗体本身会诱导细胞毒性antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC），也有补体辅助效应，补体介导的细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity, CDC)、有的在抗体上连接了有细胞毒性的小分子（即Antibody drug conjugate, ADC。关于Herceptin到Perjeta再到Kadcyla的30年，日后有时间再整理一下，一样非常有趣。）、放生性元素等，主要目的是靠抗体靶向，再诱导细胞死亡、凋亡等方式清除癌细胞。（不得不说，这里太多的应用都是源自基础研究，这也就难怪现有许多科学家希望冷门的研究也同样获得政府的支持。）

(b) 多肽介导. 知道抗原决定簇的前提下，可直接合成较短的多肽，直接提供给未成熟的树突细胞（DCs），之后DCs会将此递呈给T细胞，诱导其激活。

(c) 重组T细胞。这种方式就是傻瓜型的，但是这已经更接近CAR-T了。人们利用基因重组技术改造T细胞，使之自身能够表达要识别的抗原的多肽，这样更能提高T细胞被激活的效率。

(d) CAR-T。看到这里我已经大概知道她是什么了。利用具有灵活性、特异性的抗体靶向，作为导弹将T细胞带到癌细胞那里去。

在过去的一年中最热门的免疫治疗应该属于PD-1和PD-L1单克隆抗体药物，陈列平教授发现PD-1分子后人们对免疫抑制有了新的概念：原来有这么重要的一个分子在癌细胞中大量的表达，是他们放缓了T细胞的脚步，是他们让人们提出免疫节点的概念（原来免疫细胞也可以有check point，还以为只有细胞周期中特有的概念呢）。看到一篇文章（Ohaegbulam, K. C., et al. (2015). Trends Mol Med 21(1):24-33.）提到多家专注于免疫治疗的巨头公司早已参与PD-1和PD-L1的药物研发，比如PD-1抗体：CureTech的CT-001（pidilizumab），Merck的MK-3475（lambrolizumab，pembrolizumab），BMS的BMS-936558（nivolumab）等等，PD-L1的抗体：除了BMS, Merck外，Roche（MPDL3280A）也有自己的研发团队。

早些时日听Su提到PD-1的发展，几家公司之间的竞争甚是激烈，后来才渐渐清楚这个分子到底是什么，后来也就听说了免疫治疗，以及这频繁更新的前沿技术。话说几个月前我还在纠结于为何偏偏“癌细胞要过表达PD-1”？后来恍然明白，癌细胞来自于正常细胞，正常细胞为了避免自身体细胞的“误伤”，自然要表达一些分子贴在身上，告诉T细胞我们是朋友，不是敌人，比如PD-L1/2，B7-1， HLA-G， HVEM，Galectin和B7-1/2（这个就是更早期的发现，与  CTLA4相互结合的分子）。而癌细胞的基因的突变或许有某些方式恰好上调了PD-1分子的表达，多方因素才让他们得以猖狂的扩增，最终形成在解剖学上形成可见的肿瘤。

那么，T细胞和抗体联合作用，是否会更好？这便有了Chimeric Antigen Receptor T cell Therapy，CAR-T（嵌合抗原受体T细胞免疫疗法）。

去年十一月份搜索了一下全球免疫治疗的临床研究情况：约1700项研究进入临床观察阶段（如今接近1800），而其中有48项CAR-T的研究（如今增长到58项），主要集中在美国和中国。记得去年2015年10月17日，中国CAR-T多中心临床研究项目在天津正式启动。该项目将在18家医院成立临床研究中心，40多位专家参与临床研究，希望在这个领域我们始终有着前沿的技术和成果。

那么，CAR-T到底是如何实现的？需要哪些技术？

其实这个问题不难理解，只是难于操作，因其需要多方面的知识柔和在一起。我们已经知道T细胞的受体的组成部分（我个人理解）：胞外区、跨膜区和胞内区（细节过于复杂，我还没能掌握），主要是由几条链组成的复合体（TCL-CD3 complex），但其功能主要还是：结合抗原肽，传递信号。这个复合体和CD28分子协同调节T细胞的激活：signal 1，TCR与MHC呈递的抗原肽结合，激活T细胞，释放细胞因子，诱导细胞溶解等；signal 2，CD28和CD80（B7-1）或CD86（B7-2）分子结合，促进T细胞存活、增殖并维持他们的活性。人们知道了各部分的作用，就会有人想着改造受体，只要实现那两个功能，就可以模拟T细胞受体的功能。

于是就有了第一代的CAR-T（参考Barrett D M,etc., J. Immunology, 2015）。在上世纪90年代人们在研究HIV的时候，将CD4分子与TCR的ζ链（zeta chain）融合在一起，可以激活机体对HIV的免疫攻击；也有人发现ζ链自身足以偶联受体相关的信号转导通路；于是有人将抗体用于识别抗原的单链可变区（Single-chain variable fragment, scFv）与TCR的ζ链融合在一起，实现了信号从细胞外转导入细胞内的过程。

后来人们发现这种重组的TCR激活T细胞的作用并不明显，怀疑胞内部分的ζ链的转导、激活效果不够充分，有人将另外一个重要分子（CD28）的结构域连入其中，这边是第二代的CAR-T。被试过的协同刺激分子的结构域来自CD28、CD137（4-1BB）或是OX40，人们发现这是有帮助的，因为重组后的T细胞的获得了更强的T细胞杀伤效应、更高存活率和更快增殖等等。看过一篇文章比较了CD28结构域的作用（Textor, A., et al. 2014, CancerRes），不仅涉及到scFv的动力学分析，先要选择一个亲和性最合适的胞外区也比较重要。筛选到成功表达IgG和CD8（T细胞表面的分子）的重组T细胞后，就可以比较改造后的TCR效果如何了，比如在动物模型中的T细胞的增殖水平、分泌细胞因子的能力，攻击病毒或肿瘤细胞的能力等等。

但是看到这一点，就会有眼光犀利的人：如果再加入一个信号转导所需的共刺激的结构域会怎样？这就是第三代的CAR-T。Zhu, X., et al. (2015). " Oncotarget 6(1): 171-184.中的一张图让我看到人们是怎么修改这个受体的：

抗体的轻链和重链靠二硫键相连，取下各链识别抗原的可变区再用一段Loop多肽连接就是重组T细胞的抗体识别部分。细看这一段融合蛋白，还包含集落刺激因子2的受体alpha （colony-stimulating factor-2 receptoralpha, CSF2RA），c-Myc标签，CD8的跨膜结构域，CD28, 4-1BB的信号转导结构域 和 CD3的 ζ链这就是重组后的TCR，便于筛选阳性克隆，还连有潮霉素的抗性基因（Puro⁺）和一段自我剪切的多肽（T2A），这段DNA在真核启动子EF1（EF1 alpha promoter）下起始转录和翻译。两端的 invertedterminal repeats (IR)来自一个转座子的载体，利于构建稳转细胞系。利用标签抗体筛选阳性克隆后，就可以分析此重组T细胞分泌IFN-γ， CXCL-9，CXCL-10和IL-6的水平，也可比较T细胞的转移能力、作用时间长短（有效期）、在病人体内的增值能力等。

到了这里，接下来的问题就是技术上如何实现CAR-T的治疗了。我喜欢病毒载体系统，得益于当年在南开大学病毒学实验室的训练。那些带有包膜、可携带外援基因的病毒包装系统，可以很方便的转移目的基因并可高效整合入基因组。她虽说不像CRISPR/Cas9那样引起特异位点的“knock-in”，整合入基因组还是比较容易的。当然，基因转移的技术如今已经很多，且比较成熟：

大致路线可为：搜集病人白细胞，分选T细胞，刺激、活化、促使其增殖，再将重组的T细胞受体转移到T细胞中，确认成功表达，再重新输回病人体内。其实每个过程都不是一件省事的工作，目前还无法实现高通量、自动化，这就真的需要精准医疗、个性化药物（一个人的细胞只能这个人用，若是有人研制出没有免疫耐受的T细胞，或许可以实现off-the-shelf“药物”。）。

现在看来这确实不能看成是药物的研发，是Su告诉我这是一个Procedure，同样在临床可以用于治疗。同样在二战末期或结束不久（也就是上世纪50年代附近，太多太多的极其重要的发现都是这个时候，至少我感觉DNA双螺旋、化学键、量子力学的应用都是这段时间开始得到重视的），人们发现BCG（bacille Calmete-Guérin）可以去除一些肿瘤；直到1986年FDA批准IFNα可以用于治疗癌症；再到后来2010年sipuleucel-T（Dendreon公司研制，APC8015, Provenge）被批准可用于治疗前列腺癌，这种依赖免疫细胞的免疫治疗渐渐的走入公众。

关键是人们看到了成功的案例。最有希望在明年上市的就是Novartis的CTL019，前几天看到一则消息称CTL019在PhII的数据显示有93%的完全缓解率，与PhI的数据（92%）一致。这个CAR-T主要靶向急性淋巴细胞白血病（Acute lymphoblastic leukemia, ALL）的B细胞，目前发现CD19只在B细胞上表达，而增殖失控的B细胞在血液中会消耗绝大部分的养分，导致白血病。靶向CD19分子的CAR-T可以成功清楚这类B细胞，减缓病情。当然也会减少正常的B细胞，至于如何再提升患者的体液免疫我还不清楚，感觉可能通过输回他人正常的B细胞，或者扩增患者正常的B细胞，或者通过其他免疫或化学疗法维持体内的安全。

如今CAR-T三巨头Novartis、Juno(市值43亿美元)、Kite(市值28亿美元)已经做了大量的临床数据，曾公布了其CAR-T细胞治疗技术在恶性血液疾病中突破性的治疗。再如Celgene、Cellectis，GSK，Pfizer和J&J等都投入到了CAR-T疗法的研发中。

看到这里，我就知道CRISPR/Cas9技术和CAR-T间潜在的联系了：改造T细胞的基因组。去年看到Juno牵手MemorialSloan Kettering Cancer Center 和 the Fred HutchinsonCancer Research Center，Kite联合NationalCancer Institute，而就在不久后他们又分别与Editas Medicine和Intellia Theraputics展开战略性合作，期盼在重组T细胞上获得突破。

CAR-T在血液性的肿瘤中确实有潜在的优势，目前在实体瘤上的成功报告还鲜有，但也有课题组朝这方面努力，有些难题依旧需要人们努力攻克，比如如何产业化应用这套技术？如何判断CAR-T在体内的安全性？如何增强其对癌细胞的靶向性和毒性？如何增强其在体内的增殖能力？如何与其他治疗方法联合？可持续关注，深入了解这项前沿技术，期待早日看到合作后的最新成果。

后记

查阅一项新的技术能感觉到科技的进步，许多年轻人们提倡科学技术、科学发展、科技创新等等，都离不开科学。几年前在生命科学学院学习的时候听到各位老师讲述每一门课程的发展、绪论、应用等等，那时真的感觉不到科学能带给我们什么，或许是当时对太多实际的应用没有切身的了解。因为无知，才荒废了那么多宝贵的学习机会；因为无知，见到宝玉也只能看成石头。现在看着人们发表一篇又一篇重要的文献，能从中看到亮点，加以改造并应用，这是我目前的兴趣所在，前提是我要懂得如何去思考、如何应用。这需要更多的历练和阅历，能够和真正的只要公司开展更多的合作，这将很有帮助。

CAR-T之所以这么热门，我想也是由于没有与之竞争的领域。在新型科技中能得到人们如此的关注，一方面得益于宣传，更重要的还是技术本身，她拥有被争取的价值。看到如此广泛的市场，有谁愿意在一旁等待可行性的结果？在总结这些过去的时候，我有一种直觉或是期盼：何时自己能够预测下一次的新型技术是什么？如何能够创造一些新的技术？如何能够看出有前景的靶点？回到现在，如何能够快点了解世界上的变化？如何能够接触更多前沿的研究？如何能够快点成长、快点学习？我并不希望总是归纳总结别人的过去。

年会上老总说公司的目标是小分子药物研发领域的领导者，这就注定了公司在这方面不会有市场，更不会朝着这个方向努力，只能旁观看看热闹罢了。不了解公司内部有多少了解免疫的员工，没有人给讲授一番倒是可以邀请外界学者过来普及一下。有些知识可以不用，但不能不了解；有些事可以不亲手做，但不能不知道形势。

TJ Pharmaron

2016年1月28日星期四