The CRISPR Craze

无论展示的如何，首次报告就这样结束了，瞬间觉得双肩轻松许多，又可以在业余的时间做些自己喜欢的事。数星期以来的紧张筹备没有白费，从一无所知，到跟踪最新进展，我能感觉每一天所获得的信息，看着CRISPR近二十年的发展，仿佛自己也在这场变革之中。假想，如果我出生在发现DNA或发明PCR的年代，我会一样的兴奋和激动吧！可以看到一场技术的更新，这比阅读小说来的刺激。我想现在专注于CRISPR的人们最需要的就是时间，所有人都在和时间赛跑，谁跑在了前面，谁的名字就会记载在史册。我初次听到CRISPR也是在去年的十月底，那时感觉这一定是非常高大上的技术，想要掌握这项技术一定需要几年的历练吧。现在看来，技术本身已经平民化，并非是遥不可及。日后不知是否会用到，想回顾一下近期的筹备工作，留个纪念。

故事开始于那次短暂的交流。

偶然的一次在自己的朋友圈里添加了公司BD部门的Dr. Erich Grimm，他很热情，恰巧那次他回国见客户，这样我们有过一次短暂的交流。那是我第一次走上公司主楼的顶层，就在CEO办公室的对面。我很是兴奋，有种初生牛犊的感觉，只是聊聊而已，没有什么可紧张的。巧，Erich是德国人，他的家乡距离我当年待过的Heidelberg不远，那次圣诞节我骑车到Frankfurt还穿过了那里。我们聊到Friday Seminar的时候他很支持我直接过去找CEO说你要一次机会就好啊，So easy!随后的周末我给Su发了邮件，表明我想在公司内部做一次Presentation的想法，他很支持。那时是11月下旬，自己手里的项目马上就进入了关键时期，不知自己是否有时间准备报告，我初步定在年前，就在1月的下旬，我需要两个月的时间。

一个星期过后我得知自己得到了这次机会，便开始搜集资料，从那个时候开始家里的电脑又一次回到我的手里。无论是WeChat、科学网、生物谷、生物通、生物探索…只要和CRISPR相关的链接我都要扫一眼，有用的消息就收藏，Su也给我转发了一些总结性的文章，很受用；EndNote将近20年代文献全部下载，计划着每天浏览几篇文献，找找感觉；打印关键性的文章，精读研究，了解人们是怎样应用这项技术；手机各种可能有用的图片、讨论，关注各大公司在此领域的进展，搜集关于CRISPR的演讲、辩论等等，没过几天，进入12月，需要将注意力转移到项目上，直到元旦后的星期一，CEO办公室的Kelly电话告知我演讲的日期，正如我所期盼的那样：Jan. 22, 2016。

我计划首先大量阅读文献，直到报告前的那个周末再开始做PPT。之后的每一天，我都会打印2~3篇文章，回家得空就看，感觉又一次回到了博士答辩时的节奏。了解一项技术不难，几篇综述就能摸清里面是什么，但要如何展示，这是个难题。好与不好，全在你准备的如何。不得不说，我的老婆很有天赋，虽说她不怎么懂生物，她的问题都是很关键的：CRISPR是什么？有什么用？怎么用？就是围绕这这几个问题，我也给自己列了一下大纲：要介绍该技术是如何发现的，是如何在短短几年发展的，应用在哪，有哪些危险，社会各界人士对此反应如何，前景怎样。简单细化一些，比如CRISPR的全称是什么？源自何处？Cas9又是什么？怎么发现的？有9就一定有其他的成员，他们是做什么的，Cas9有何独特之处？问题一个接着一个出现，但都是些简单的问题，余下的就是从文章中寻找答案了。

我浏览了EndNote中的三百余篇文章，挑选了二十余篇技术和综述性的文章，其中，就有The CRISPR Craze（Pennisi E. 2013. Science, 6148:833-6.），这是2013年的一篇评论，文字部分不足2页，简明的介绍了CRISPR的发现和应用，主要是由于2012年人们报道了太多CRISPR的应用成果，Jennifer和Emmanuelle发表CRISPR/Cas9系统后，随之张锋在动物细胞内编辑了多个基因，短短的八个月，科学家报道在各种常见的模型中成功应用该技术编辑了基因组。我想当年的报道有着当年的视角，毫不犹豫的我下载了这篇报道里所有的参考文献，下不到的自然求助于公司的信息部门的老员工（刘坤），之后的几乎每一天他都会及时发送给我关键的论文，我非常感谢他的帮助。沿着时间线，我找到了CRISPR的源头，理解了Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeats中的每个字的含义，也看到了早期人们发现Short Palindromic Repeat的时候的疑惑和不解，面对那样特别的序列，总会引起一些人的兴趣，Francisco J.M. Mojica就这样走进了历史，1993年他在研究耐受盐的细菌时发现了那样的序列，之后在文献中看到了早在1987年日本的科学家也报道了类似的序列。接下了许多年，他都关注着重复的序列，试图阐明它们可能有的功能。可是数年过去了，他没有新的发现，只是在更多的细菌中发现了类似的序列，到2000年时他已经发现数百种细菌中有类似的重复。当然，他也分析了重复序列中的间隔序列就是那些Regularly-Interspace的序列。虽说那个时候人们已经有了DNA测序的技术，但数据库中的序列还是有限的，Mojica并没有惊喜的发现。早在1983年Kary Mullis发明了PCR的技术（1993年获得诺贝尔奖），那时人们意识到DNA序列的重要性，在全球范围内开展了人类基因组的测序的伟大计划，六个国家，中国当时因承担1%的工作还一度激动过。

有一些人们关注了CRISRP附近的序列，发现了一些ORF保守的存在与一些细菌的基因组中，在没有CRISPR的细菌中并没有发现那样的ORF，于是他们给了这些ORF新的名字：Cas蛋白，CRIPSR associated proteins。之后人们发现了各种各样的Cas蛋白，名字很多，对他们的功能却全然不知。

直到2003年，DNA序列的库存有了指数般的增长，大量的序列被上传到数据库中。1977年Frederic Sanger测通ΦX174噬菌体的序列，1980年他因发明测序的方法而获得诺贝尔奖。后来人们获得了更多的噬菌体全基因序列，Mojica终于在这庞大的库中发现了一叶扁舟：CRISPR中间的间隔序列（spacer）和一种噬菌体的序列完全一样。他比较了数十种细菌的CRISPR中间的间隔序列，发现他们大部分是来自噬菌体或是外源的DNA。随后他整理了自己的数据，将文章投到了Nature杂志，可惜编辑部因为他没有找外部审阅人而拒绝了此文章，随后PNAS认为该发现没有突出的重要性而拒绝接收，随后Molecular Microbiology 和Nucleic AcidResearch杂志一样拒绝了他的文章，18个月以后，J.Mol. Evol.发表了他的成果，那时已经步入2005年（我刚走进中山大学的校门）。

刚看到这样的发现我还无法想明白它们会有什么重要性，可再仔细想想，还真有可能有重要的作用。现在我们已经知道了许多调控类的RNA，也发现了许多RNA相关的保护机制，有人就推测这种间隔序列转录成RNA后，中间的CRISPR可以互补，之后可能被RNA的内切酶Dicer切断，产生短链的RNA（~25bp），这与RNAi的机制中起作用的RNA一样，难道CRISPR在细菌的内部扮演的真核细胞中的RNAi，进而干扰细菌病毒（噬菌体）的复制？确实有可能，还有人推测这种短的序列会与DNA的修复机制有关，还有更多的猜测。

Mojica的发现吸引了许多微生物学家，尤其是噬菌体领域的学者的关注。直到2007年的那家生产奶酪、乳制品的公司发表他们的发现：CRISPR给细菌提供了获得性免疫，抵抗噬菌体的复制。升级了人们研究这段重复序列的兴趣，更多的研究力量投入到其中，可以参考Broad研究所主任Eric S. Lander在Cell上发表的The Heroes of CRISPR（Eric S. Lander, 2016, Cell）。很巧，就在两周前，我在Cell定期的Alert里面看到这篇最新的文章。和Lander的总结比起来我心中的设想就是小巫见大巫了，感觉这篇文章发表的真是即时，正在我需要一篇类似综述的时候它就出现了。好久没有这门渴望尽快的看完一篇文献，当天夜里我仔细阅读了里面的每个故事，标记了其中引用的文献。连续的三天，我反复的琢磨里面的细节，终于拟定了自己的思路。融合了Craze和Heroes的部分，就是CRISPR发现的主体。而张锋的那篇应用性的综述可作为第二部分展开描述。而第三部分，可以是最最新的市场应用。

话说发现CRISPR可为细菌提供获得性免疫，这可是头条，是全新的热点，值得那么多人关注。可谁有能想到，后续有人将这一套序列转移到另外的细菌，使之获得抵抗噬菌体的能力，实现了可控；谁又知道，有人验证了她的靶标是DNA，而不是RNA；又是谁一眼看出了她在在基因组编辑领域的优势；之后就是2011年的那篇文章，2012年的那篇（参见A story of CRISPR/Cas9 (I)），之后她便霸占了CNS等杂志的头条，再头条。

又一次让我看见，机会为什么都是给有准备的人，是不是应该说只有有准备的人才能创造机会呢？一位是从事非编码RNA的专家，一位是专注于RNA结合蛋白结构解析的权威，Jennifer和Emma的偶遇，数月过后二人的杰作就与大家见面，是偶然吗？一位研究光调控发生学的青年科学家，苦于寻找更为简易的方法将基因插入到神经细胞的基因组中，虽说TALEN的技术比ZFN有明显的优越性，可还是过于复杂，效率较低，需要编码新的DNA结合蛋白靶向DNA。这个时候张锋无意中听说CRISPR，怎能不吸引他的兴趣？一条RNA就完成了靶向，怎么可能有如此简单的事情？多年从事基因组编辑的研究，能首次将她应用于真核细胞也就不足为奇了。现在大家都需要时间，彼此追赶。

这两年关于CRISPR的综述也渐渐的多了起来，不同层次解读该技术的细节和历史，还有广泛的应用前景。各大CRISPR相关的公司也相继发布科研的最新成果，有太多的文章是隔天就被接收。看到一篇最新的文章会有小小的激动，因为作者的发现真的是太及时、太重要的了！不知CRISPR/Cas9的系统用于致病性功能基因的筛查，是否会替代RNAi的技术？像Novartis这样在免疫治疗领域比较活跃的药企也要抢先应用这项新技术，比如Juno，Kite也不想放弃这样好的机会。Sanger研究所和AstraZeneca也想联手打造CRIPSR交流平台，这就是一个好迹象，是一项新生技术逐渐被大众接受的迹象。在颇有争议的社会伦理问题、“off-target”面前，没有人愿意等待，没有团队想坐等、错失先机。

有许多文章是几家单位联合发表的，这也可以看出各位通讯作者存在长期的合作关系，结构生物学家和遗传学家，噬菌体学家和细菌生物学家等等，专利之争也逐渐的让人们看到了两大阵营中的课题组，看到了几家单位之间的合作与对立，曾经的盟友变成了现在的对手。科研，有时也如商战，这不仅决定发明权在谁手里，也会直接影响该技术日后如何应用，在哪里应用，谁能不关心！看着文章，好比看着小说。和一个月前相比，速度明显提升，或许是太多重复性的方法和引文，已不必再细究作者使用何种描述，扫一眼就知道这篇文章的创新在何处，话说这种感觉在博士期间也少有。只能说自己看的文献还是太少，这种感觉来的太晚。

上一个周末，PPT的初稿完成了，周三之前基本成形。直到周五的上午，调整动画，删删减减，反复检查里面的字体、格式、引文格式，甚至对齐方式、动画先后、速度延迟等等，在报告前的三个小时，定稿了。后来想想，如此细致也不是那么重要，听众的分辨率太低，他们根本无法注意到其中的细节，是自己太矫情了！这是一次机会，在没有得到以前是那样的憧憬，在经历过后又会有新的期待；这是一次锻炼，无论是阅读、梳理、展示，都需要有整体的规划，如今准备一次PPT已经不那么费力，大量的时间都在脑中处理。

现在想想，如此火热的技术，为何我在两个月前才听说？为何从未听到同事谈论此事？相比在高校，早早就会听到相关的报道吧。只能说公司的交流过于匮乏，或者我的消息过于闭塞，竟然这么晚才听到这项已经火便全球的技术。无论是在免疫治疗（T cell engineering, CAR-T）、精准医疗、构造动物模型、致病基因筛查等领域，她都有着很大的潜力。有时我禁不住想早日看到这项技术用于HIV的医药研发领域，早日看到改造后的T细胞能抵抗HIV的感染；我想早日看到CRISPR能够解决一种遗传性疾病；能够有更高效、更简易的升级系统，无论是Cpf1还是SpCas9-HF1，希望早日发现一种没有“Off-target”的编辑系统面世；我也想看到是否能在高等生物中发现类似的现象：RNA介导靶向切割DNA。如今的技术能发现之前的非编码RNA已经能编码多肽，那就可能会发现RNA会有更多新的功能。虽说生命科学的认知是有限的，哪一种学问又是无限的呢？只有无限的未知，和永无止境的探索。

期待下一次的机会，在这混沌的世界，我想有自己的一片净土。

（PPT已上传，请指正。）

CRISPR-TJ-1.22.pptx

TJ 南海家园

2016年1月23日星期六