A story of DNA (I)

Lilly：“中心法则是什么？”

Me：“简而言之，是DNA经转录到RNA，再经翻译变成蛋白的规则。但在病毒的研究领域中早已拓展了很多，比如RNA到DNA， RNA到RNA，已经比较复杂了。”

Lilly：“诶？看，我一个外行随便就能问住你哦！”

这些知识还是来自初高中时的课本，现在看来，当时所学的内容还有很多值得推敲的地方。这么多年我都认为我很了解DNA——不就是DNA嘛，他已经是一个基石，可以在此基础上探讨后续问题。如果Lilly问我，DNA到底是什么？怎么发现的？我很想重新梳理一下关于DNA的故事，以便以后有小朋友会问我。

先从两篇文章说起吧，我还在纳闷，为何之前从未阅读过这些文章？

第一篇：Griffith, Fred.The significance of pneumococcal types.[J]. Journal of Hygiene, 1928， 64(2):129-i4.

这边大作首次描述了转化（Transformation）的现象。我不是一个爱问问题的学生，从未质疑过为何称作转化？什么又是转化？他是什么样的转化？和变化有什么区别？其实很简单，作者选用了一种肺炎双球菌（Streptococcus pneumoniae）的两个亚型，一个表面粗糙（Rough，R）的Type II，一个由于表面被糖包裹着而光滑（Smooth，S）的Type III。由于多糖的保护，S型在体内会逃避宿主免疫系统的识别而表现出致命性，当时战乱的年代这种细菌严重威胁人类的健康。Griffith从病人的体内采集病症样品，经过多年（1920-1927，or even longer）的培养和观察，他发现了多种血清型的S. pneumoniae（当时利用血清给细菌分型算是最灵敏的手段），并跟踪R和S型的变化。在几位病人的分离的样品中他发现Type II细菌比例在逐渐减少，而Group IV的细菌比例再逐渐增加。这种此起彼伏的感觉他意识到了这两种细菌间存在着某种联系，或转化。

后来就是大家耳熟能详的经典实验：肺炎双球菌的转化实验。我感觉作者能发现两种表型差异明显、不同致病性的细菌已经很了不起。他没有停下脚步，深入研究了这种可能发生转化的现象及其背后的原理。

文中所做的实验和分析阅读起来感觉很复杂（关键是我的英文阅读能力太差），耗时耗力。在当时的年代，对何为Gene还存在疑问，虽说人们已经知道细胞中有核酸（核糖或脱氧核糖）的成分，当时人们认为蛋白质更像是Gene（不知是否已经有“遗传物质”的概念），更不要提如何分离和纯化DNA，不得不费尽周折的描述自己看到的现象。Griffith培养了大量的R型细菌，做了详细的传代记录：样品来源，处理时间，传代时间，致病性等等，可以定位到任何一代次的细菌及其致病性的结果。他看到接种少量的R型细菌并未在短期诱发小鼠死亡，但大量的R型细菌也会引发小鼠死亡，只是和S型细菌的相比，死亡比例是很小的。热灭活的S型细菌本身已无杀伤力，但和少量的活的R型细菌共孵育一段时间，便获得新生（有点借尸还魂的意思），再次表现出疯狂的致病性，这时的细菌表现成S型，且可以繁殖、传代，而且在死去的老鼠体内能分离、培养出S型细菌。看到如此般现象后作者依旧没有停下，而是继续探讨之前发现的多种血清型的S. pneumoniae之间是否也存在如此般的转化。验证了他之前的猜想：Type II和Group IV间的细菌确实存在着一种联系——转化。

这是1928年的发现，全新的发现。可是，在当时并没有引起很多人的注意。虽说后续Griffith的实验室有人接着深入研究，也没有引起多大波澜。话说：是什么决定了细菌的表型？为何只发现R型向S型转化的现象，为何没有看到反向的转化？这篇48 pages的文章只是在结尾说出细菌可以发生转化的现象，有一种“principle”被转移了。

接下来就是二战即将结束时Oswald Theodore Avery 和他的伙伴们发表的一篇文章：

Avery, O. T., Macleod, C. M.,& Mccarty, M.,. (1944). Studies on the chemical nature of the substanceinducing transformation of pneumococcal types: induction of transformation by adesoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus type iii.. Journalof Experimental Medicine, 79(2), 137-158.

本文延续了Griffith的研究，这次的实验高明之处在于将能够引起转化的成分逐步分离出来。那时已经拥有了分离糖、蛋白质、核酸的技术，也有裂解或分解多糖、蛋白质、核糖核酸和脱氧核糖核酸的专一性的酶，只是人们还不知道到底哪一个成分是“Gene”（那时的主流思想依旧是蛋白质是遗传物质，Linus Pauling已经获得了规则性的蛋白结构，alpha helix，并已初步描述了肽链合成的规则）。此外，人们对R型和S型之间的转化有了更细致的发现：R型细菌在有anti-R的抗体血清中培养，也会转变成同源的S型；在许多动物的血清发现存在某些酶能够阻止这种转化，60-65℃热灭活这些酶之后即可出去这种抑制效应（当时还没有有效的经验支持选择哪种血清合适）；实验中可以得到有S型转化成的R型，只是此时的R型容易发生反向的转化，再次变回S型（确实有点奇怪哦），Avery就选用了经Type II 的S型传代（36代）后产生的Type II 的R型（R36A），此菌株只是在平皿中表现为Rough的菌落而已，并且相对较稳定，不会再短期内自发转变回S型。在后续的实验中作者尝试了多种细菌组份，此R36A发生转化成Type I，TypeIII或Type IV的S型细菌，却从反向转化成Type II 的S。另外，当时人们已经发现在细菌内部存在一种酶，在自发裂解的过程中该酶能够阻止转化的发生（估计是一种DNase吧）。巧妙之处是作者设计了一个方法，能够计算或比较转化的效率（这种方法沿用至今）。

是的，激动的时候就要到了，Avery的实验完全推翻了过去数十年的说法，一个全新的说法挣脱了世俗的观点：遗传物质就是DNA。

Avery看到Griffith的文章后非常感兴趣，迫不及待的想知道这个“Priciple”是什么，他是如何使的R型细菌的外表重新包裹成糖衣而变成致命性的S型。Avery等人裂解了细菌，与R型细菌共孵育，依旧产生了向S型的转化，说明Principle在细胞裂解物中。之后用一种讲解糖衣的酶（SIII）处理裂解物以后，依然检测到了转化的现象，这说明转化并非是重新组装了热灭火的S型细菌的糖衣；接下来再用水解蛋白质的酶（crystallized trypsin and chymotrypsin）处理无多糖的裂解物，依然得以发现转化的现象，排除了蛋白质诱发转化的可能；作者接着用氯仿去除蛋白，乙醇沉降剩余的核酸（DNA和RNA）——这是首次在肺炎双球菌中分离核酸。将沉淀出的物质溶于水后，作者先用RNase处理一段时间，发现依然具有转化的能力；最后一步实验，作者选用了降解DNA的酶，DNase，终于阻止了转化的发生。

故事到这里，如果是我，或许就已经认为该结束了。作者通过化学元素分析的办法，分析了最后剩余的DNA样品，计算了N/P的比率，1.58~1.75，与脱氧核糖核酸中的N/P（1.67）非常接近，但不排除有污染蛋白质的可能。（之所以不能忽略蛋白质的影响，还是源于多年来人们更倾向于蛋白质才是遗传物质，在最可能是Principle）。如果有糖或蛋白的污染，N/P的比率的变化范围会更广。作者坚持自己的实验结果，得出是DNA引起的转化，这个神秘的Principle就是DNA。

无独有偶，除去洛克菲勒大学的实验室外，同在美国东方的冷泉港实验室和丹麦哥本哈根大学的实验室，一组研究噬菌体的大家们落下了“DNA是Gene”收官之笔，噬菌体是什么？他们是如何被发现的？噬菌体的研究是如何的？噬菌体在发现DNA的过程中又有哪些奇闻异事？我想查阅一些古老的文献。

后记

不知一战是否影响到Frederick Griffith对肺炎双球菌的研究，也不知二战是否耽搁了Oswald Theodore Avery对转化实验的延续，但我确定的是战争确实耽误了中国人在这一领域甚至所有科研领域的进步。清末李鸿章提出“师夷长技以制夷”的战略思想，如果当时有条件，在“上帝造人”并非主流思想的清末，在首创“人痘”疫苗的清末，我想我们是有条件走在科技的前沿的，毕竟科研需要有积累。

曾有人说，现在是历史当中最好的时代，我很赞同。只要你想做什么，就可以去做。近期跟踪CRISPR的研究，才发现科技的发展原来可以这样的快。现在的交流更为便捷，顶尖的发现可以在1~2天的时间被发表，热门的研究先后三个星期便会决定一个抢手的专利花落谁家，同一类研究可以前后一个星期发表在顶尖的杂志。和上世纪中期相比，现在的进步是突飞猛进、爆炸新闻。张峰、黄军就等人多研究确实引领了CRISPR技术，站在了国际的最前沿。我能感觉到，在国强、和平的时代，科技会迅猛的发展，期待十年以后国内是另一番景象。科研体制、经费制度、自由学术氛围，虽说有少数人在推动科学体制的变革，这毕竟是一个耗时的过程，需要等待。到那时，获得诺奖便不会如现在那般轰动了。

TJ Pharmaron

2016年1月5日星期二