《ICE成药靶点探案系列》

峰回路转，灯火阑珊

——记POLQ MMEJ reporter assay 优化历程

在ICE做实验，大家的商讨很多，尝试很多，失败很多，挫折很多，重复很多；

经过一阵子的煎熬，突破很多，意外很多，成功很多，收获很多，思考也很多。

我们这里有实习生，有年轻的同事，这次想和大家分享一些科研趣事，也希望给年轻人一些启示和参考——实验不易，切莫轻易放弃。（文末有彩蛋！）

主要的实验目的，是重复下图中的结果¹。实验设计的很巧妙，此方法可用于在细胞中评价Polθ（DNA polymerase theta，Polθ, encoded by POLQ）²的活性，相关背景可参考爱思益普的李涛同学撰写的一篇帖子（全面助力新药研发，挑战DDR靶点之POL θ--李涛），在此不做过多介绍。

经过近一个月的努力，ICE也顺利的得到了类似细胞活性数据：

此处想简单描述下MMEJ（microhomology mediated end joining）的细胞原理，之前有文章探索过Polθ的修复能力³，对于45 nt长度的单链可以完成双链修复，有4个碱基配对（所以称之为microhomology mediated，几个碱基互补即可开始DNA聚合）即可完成修复。当然，这只是DNA众多修复方式中的一个，并非能100%完成修复，这也一定程度上解释了文章的结果error bar比较大，猜测assay window和稳定性都不是很好把控。

为了构造类似的修复方式观察Polθ的修复能力，文中选择了Nanoluciferase作为报告基因，可能利用其灵敏性较高的特点，结合SV40转录终止子和CMV启动子，构建了MMEJ的底物。

根据文中描述，有几个地方，看似容易，我们的团队为此做了很多探索，困惑和惊喜都藏在这里：

选择Nanoluciferase，SV40和CMV的序列相对简单，如何选择两端的单链突出（4条引物）？文章说突出45 nt，如何选择酶切位点？CMV的序列该选择多长？如何引入酶切位点？启动子的基本构造是什么？TATA BOX附近哪些序列不能改？CMV的序列哪些和活性有关？片段的连接是否和质粒连接一样？如何评判连接是否成功？如何判断退火效率？

很多时候，遇到了问题才想到这些。现在有些后悔当时上学没有好好的听课、做笔记，这个时候需要的就是基础的分子生物学（酶切+连接）。

原理很清楚：变性-退火-连接-OK。

实际确是：变性-退火-连接-（循环n次） -变性-退火-连接-OK-变性-退火-连接-OK

实验遇到问题，需要去解决，需要重复确认，要以科学的思维为导向，这一步做错，会影响后面一连串的实验。所以在ICE，我们提倡要以做原子弹的思维做好团队间地配合。

Run 1：摸索4条引物和底物的连接比例，初步尝试，貌似看到连接产物，可是其余条带是什么？

接下来就是重复，改变些条件，继续看看：

结果都看到类似的双条带，看来这个结果在目前的条件下，是符合一定的原理，是真实存在的。这里就引发了新的讨论：

出现的条带，貌似是连接产物大小的两倍，难道是连接产物，自连了？可是根据下面的示意图所示，自连是如何发生的呢？难道T4 ligase除了连接的作用，还有聚合的作用？难道有和Polθ类似的功能？内心觉得，这个不是很好解释，不可能。

T4 DNA Ligase

·       Catalyzes the formation of a phosphodiester bond between juxtaposed 5' phosphate and 3' hydroxyl termini in duplex DNA or RNA.

简单搜索一下，并未看到T4 ligase有聚合修复的作用。于是我们安排了测序，看看上面的条带是什么。当然，第一次失败了，测序没有测出结果。

Run 2：重头开始，QC每一个步骤。确保退火成功

电泳检测了之前的退火片段，看似还可以，问题不大。后来ICE根据自身的DNA退火HTRF和TR-FRET的实验经验，优化了退火的buffer，也改变了退火降温条件，逐一尝试，终于获得了更干净，更纯的退火底物，到此，引物退火成功。

这个结果，主要是元旦假期间出来的。

Run 3：优化连接，尝试不同的dsDNA浓度，貌似看到增大的条带，不过还是有两条带。暂时先不纠结这个问题，继续向前走。

Run 4：陆续提取质粒，酶切，连接不同批次。

电泳结果所示，让人大失所望：怎么连接的条带不如未连接的大？到底发生了什么？哪里出了错误？

继续尝试，继续验证，all negative！结果让人不解，让人头疼，况且，这个时候即将过年，同事们陆续启程，回家。我们不希望带着这些负面的结果度过新年。大家仔细回忆实验的细节，到底问题在哪。又是一次次的尝试。

这个时候，做了八年多ADME的丽丽同学和大家说：之前跑过一次条带，上样量，引物的浓度，电泳时间，都会影响这个图。而这几次的对照都是酶切产物，不是连接产物的对照组（此处是指no T4 ligase，但是有引物），会不会有影响？

结果我们试了一次，比较了含有引物和不含有引物试dsDNA的电泳情况。

果然！被她说中了！

但是我还是怀疑，这个不太合理，不过也有可能。如果电泳时间足够长，是不是右侧的两个条带，会跑到一条线上？不管怎样，保证背景条件类似的情况下，之前清晰的结果，还是可以重复的。可以说，到这里，我们有把握再得到准确的连接产物。

为了验证，又一次重新引物退火做起，连接，电泳，在除夕的前夜，接近午夜，电泳了45min，我们拿到了如下的结果：

一切疑惑，问题，都在这张电泳图面前解开了。

我们对视一笑，收拾东西，准备回家。外面已经开始下起了雪。瑞雪，虎年好兆头！

我把这张图发给了公司的BD团队，作为新年礼物。到了这里，我们解决了MMEJ底物的制备问题。看了看电泳图的日期，前后的工作日，我们花了三周时间提取质粒，酶切回收，五天的时间解决了MMEJ底物的制备过程。

不过又有了新的问题：如何获得大批量的底物？质粒的提取，酶切和回收，连接和回收，到了最后，能获得的连接底物已经不是很多。一般大提质粒我们需要100 mL菌液就可以用到毕业，这次我们提取了5L菌液，感觉还是不够。无奈，我们流水线式操作，才获得200 ug连接产物。

不过，这终究是技术问题，工艺问题，其实没有开始摸索时那么难了。如今我们已经找到方式获得mg级别的MMEJ连接产物，期待后续更多的优化结果。POLQ的靶点，很有意思，有很多工作可以尝试，ICE也希望为广大的科研工作者，药物研发的团队提供技术支持，一同开拓这片新的领域，加速大家研发的进程！

考虑到瞬转实验的繁琐过程，我们也考虑构建稳转的细胞系，如另一篇文献所描述，见下图⁴，方法还是有的，只是这里的assay window也不是很大，难度会不小。我们也在尝试其他新的底物设计，希望能实时的看到POLQ的修复过程和发生位置，期待新的探索，新的结果，届时再与大家分享。

围绕POLQ，ICE的团队内部仍然在开发其他酶学方法，去解决选择性的问题；也在开拓细胞学的方法，验证特异性的问题；也在筛选其他cell types，试试有效性的问题，看看哪些细胞对POLQ的抑制更敏感。

太多工作需要做，后续将围绕这个靶点收集成药性的数据，大力支持创新药物的研发。

后记（彩蛋部分）

与其说解释这个意外结果，还不如说对做出这个结果的同事表达一次歉意！当时我心急，误会了大家！

当我初次看到这个结果的时候，我说什么也不相信这个结果是按照之前摸索过的条件做的。而且怎么也不相信这个是对的，一定是哪里做错了。当时没有多想，重复了一次实验，这个现象消失了。

后来我们细聊才发现，这一组其实丽丽同学忘记加入了引物。

那就一切清晰明了，自连，并不是连接产物的自连，而是酶切产物的自连。所以再次连接时，我们增加了引物的浓度，减少酶切产物的自连，最终获得了相对纯度较高的连接产物。

在此感谢在这个实验中贡献的各位小同事们，大家的经历和付出是值得的！有过拖沓、有过厌倦、有过打击、有过反复，只有经历过这些场景的同事，才能体会美好结果的美好！后续的科研路程中，如此场景便是家常便饭，just enjoy and have fun! 多和自己说几次就好了。

在ICE实习的同学和工作的朋友，我们不要求大家有多么多的技术和知识的积累，半年，一年，不会有什么明显的收获。但是希望各位能在ICE体会到一种永不放弃的精神，不要轻言放弃，不畏惧困难，在日后的工作生涯中，继续为中国创新事业贡献力量。

ICE有着不放弃的信念：爱求索、思新异、益中国、普创新。

如何去实现，是我们现在的工作；有着大方向的指引，为科技工作者服务的理念，做事就会有动力，也会有意义。

希望看到此文的年轻同学和朋友，科研路上勇攀高峰，为中国可持续科技创新储备有生力量！

Reference：

1          Zatreanu, D. et al. Poltheta inhibitors elicit BRCA-gene synthetic lethality and target PARP inhibitor resistance. Nat Commun 12, 3636, doi:10.1038/s41467-021-23463-8 (2021).

2          Seki, M., Marini, F. & Wood, R. D. POLQ (Pol theta), a DNA polymerase and DNA-dependent ATPase in human cells. Nucleic acids research 31, 6117-6126, doi:10.1093/nar/gkg814 (2003).

3          Wyatt, D. W. et al. Essential Roles for Polymerase theta-Mediated End Joining in the Repair of Chromosome Breaks. Molecular cell 63, 662-673, doi:10.1016/j.molcel.2016.06.020 (2016).

4          Wang, Z. et al. DNA polymerase theta (POLQ) is important for repair of DNA double-strand breaks caused by fork collapse. J Biol Chem 294, 3909-3919, doi:10.1074/jbc.RA118.005188 (2019).