A story of Hepatic stellate cell (II)

无意中看到一篇文章，简单描述了非酒精性脂肪肝晚期进入肝纤维化、肝硬化甚至肝癌的过程，微环境对细胞的影响不尽相同，比如纤维化的细胞和肝癌细胞会快速增殖，有人关注了肝细胞和HSC在同一环境下做出的不同反应。身边被高密度脂肪酸层层围住，主要合成脂肪酸的肝细胞也会承受不起，而夹缝中生长的HSC更是难以存活，成为始作俑者。当肝部的脂肪积累的一定程度，已经超越了肝细胞对脂肪酸的氧化、转运到血浆、储存成甘油三酯，这个时候会诱发肝细胞的脂类毒性，加速肝细胞的损害、甚至死亡，诱发炎症。[1]

这里面有两个单链和一个三条链的脂类很有意思：palmitate（棕榈酸酯）、oleate（油酸酯）和Triglyceride（甘油三酯）。向来对脂类不感冒，可能因为我不喜欢肥肉的缘故吧，再一个也是他们长的太想，我无法区分那么复杂的化学分子结构式。可是如果有人和我说高浓度的palmitate或oleate均可以诱发HSCs的脂类毒性，而肝细胞对高浓度的oleate并不敏感，或许我会研究一下他们有什么不同；如果有人说甘油三酯也是一种潜在的危险，或许我也会关注一下；再加上近期听到比较多的糖代谢、糖酵解、脂类合成、脂肪氧化、TCA等等，这些不得不让我再深入的回忆一下当年的生化课（应了李国富老师对学生说的一句话：这两本生化书若干年后要是有人还记得记住目录实属不易啊）。

早上浏览paper的时候无意中发现一篇关于Insulin研究，发表时间比较早，却让我恍然“再明白”：原来insulin是这么来降低血糖的！许久没有这样的小激动，停下来往前捯饬捯饬，发现一个与之先关、又和脂肪合成密切相关的靶点——DGAT。向来对这种陌生的名字不感冒，生物的研究中有太多没有新意、复杂又容易混淆的名字（其实接触的多了也会成为朋友）。稍微搜索一番，感觉她算上一个有点渊源的成员吧，值得深入探究一下下。本人喜欢有源头、较系统的故事。

故事可以从简单的一个分子开始。

Triglycerides(TG)

甘油三酯，也称三酰基甘油（triacylglycerol, TAG, ortriacylglyceride），看着不起眼的分子，却是体内真正储存脂肪、转运脂肪、脂肪代谢等过程的主要中间体或承载单元。今天中午Lilly问我人为何要吃饭，虽说这应该是凡凡该问的问题，可直觉告诉我，因为体内的细胞需要吃饭！表面上看我们有着human body，可到了分子层面估计细胞看不到她们世界外部的“人形”，不得不相互协调、大费周折从外部摄取能量，再经过胃、小肠等部位反复洗礼后吸收有用的营养成分。而其中主要的糖类经肝脏后会被肝细胞摄取、再经细胞内部的线粒体TCA循环、将Citrate释放到细胞质中，经ACL、ACC、FASN、SCD-1、DGAT等关键酶的催化后，生成TG。到了这里，肝脏已完成了大部分脂肪合成的步骤，TG和载脂蛋白ApoB结合后开始以VLDL的形式运出肝细胞（这里就好比北京奔驰的大板车天天向外运送新生成的大奔一样啊），抵达需要能量的组织后卸货，为机体其他部位提供足够的能量。如此，TG的重要性显而易见。

Shorthand (line) formula for a typical examplemolecule of Fat Triglycerides

(From Wikipedia, By Wolfgang Schaefer)

天然的脂肪或油：左半部分是甘油，右半部分由上至下分别为棕榈酸（palmitic acid ）、油酸（oleic acid）和 alpha-亚麻酸（alpha-linolenic acid），合在一起就是TG啦！

让我好奇的地方就在这里，生成关键组分TG的最后一个酶就是DGAT。因为该通路中明星酶的主要作用我曾搜索过，可DGAT于我而言是相对较新的，内心还是希望填一点空白。想知道她有哪些成员？如何发现的？有何作用？等等。

DGAT

二酰基甘油酰基转移酶，diacylgycerolacyltransferase，时常也写成acyl CoA:diacylglycerol acyltransferase，这一长串名字显示了该酶催化的过程：将脂肪上的acyl CoA转移到二酰基甘油上生成TG。（可能也是她专一的作用）下调DGAT2表达水平，可以减缓肥胖动物肝部脂肪的合成、肝坏死甚至高脂血症等症状，可以改善代谢紊乱。[2] DGAT2缺失后可明显降低组织内甘油三酯的水平，SCD1和DGAT2的共定位显现也显示内源单体非饱和脂肪酸与甘油三脂合成的密切关系。[3]短期的上调DGAT1或 DGAT2 的表达可提高肝部合成甘油三酯的水平，对VLDL或apoB的水平却无影响。一般说来，肝脏直接吸收的脂肪酸转化成的甘油三脂常与VLDL过载有关。[4]

Glucose

葡萄糖被脂肪细胞或肝细胞摄取后，通常会上调多种与脂肪发生相关的酶的转录水平，有数据显示FAS （280%）、ACC（93%）和糖代谢通路中的GPDH（633%）均有较明显的上调。[5]

II型糖尿病（type II diabetes mellitus, T2DM）通常表现为高血糖，主要因为对胰岛素不敏感或是自身分泌的胰岛素匮乏。而肥胖也是诱发T2DM的主要因素之一，因为她会导致外周细胞对胰岛素介导的葡萄糖的吸收，同时也会降低beta细胞对葡萄糖的敏感性，这种效应会随着减肥而得到好转。肥胖的主要表现就是体内积累了多余的脂肪组织，而TG的大量积累却是直接原因，而这与非脂肪细胞中的调节紊乱相关，比如肌肉和肝部。[6]

TG合成有2个主要的通路：甘油磷酸通路和单酰基甘油合成通路，而他们的最后一步都是由DGAT催化生成TG。这里还有一段插曲，Stephen L. Sturley课题组起初研究的是CoA: Cholesterol acyltransferase, ACAT1和ACAT2，[7]与酵母的基因比对后发现人源细胞中也有同源的基因。后续在不同细胞中分离到相应基因，初步用实验确认他们具有转移酰基的活性，并预测其他可能的底物，其中包括TG的合成。这个猜测在后来的两篇文章中得到确认，并且后续更名为DGAT1和DGAT2，Case等人1998年并克隆到DGAT基因。验证其合成TG的功能外，还构建了缺失DGAT1基因的小鼠，发现他们体重下降，对饮食诱发的肥胖有抵抗，雌性的小鼠泌乳还存在一定的缺陷，这也从反面证明了DGAT1在脂肪合成过程中的关键作用。可是，在细胞水平上人们依旧发现有大量的TG积累，直觉告诉大家，还存在其他的同工酶。2001年Case等人克隆到DGAT2基因，（在这里不得不感叹一下伟大的人类基因组计划，当时有太多的新基因被人们挖掘出来）并发现DGAT1在小肠和脂肪组织中高表达[8]，而DGAT2在肝和脂肪组织中高表达[9]，在同一期的JBC中也刊登了Lardizabal,K. D.等人发现DGAT2的过程[10]。可能是由于膜蛋白比较难分离的原因，DGAT在植物、真菌、细菌等生物体内的研究相对快些，在哺乳动物细胞中起步的较晚。

克隆到基因，算是奠定了基石，后续的研究速度有了明显的提升，人们知道更为细致、准确的信息：DGAT1属于ACAT家族，而DGAT2却有着特别的来源；虽说二者的基因或蛋白序列同源性较低，但其在细胞内的功能却是相似的；二者均结合在膜结构上，主要是内质网。RupalieL. Meegalla等人探讨了葡萄糖和胰岛素对DGAT活性的影响，发现在3T3-L1脂肪细胞中葡萄糖可明显上调DGAT1和DGAT2 mRNA水平，而胰岛素仅可上调DGAT2 mRNA水平[11]。看到细胞对D-Glucose的偏爱，让我想起了L-型的氨基酸，为何自然界要如此的选择呢？Why does the body prefer L-amino acids (toD-amino acids) and D-glucose ( to L-glucose)？

  Carbohydrateenhances DGAT activity by increasing the level of expression of DGAT1 mRNA

看来想详细了解肝部疾病的进程，需要对糖、脂肪甚至氨基酸三大代谢有更系统的了解，这个需要点时间将各个点串联起来。话题再回到HSC，她自身既不是脂肪、糖类代谢的主要地方，也不是肝部为数众多的细胞种类，但她却能掌握着某种平衡。不鸣则已，一鸣惊人啊！这与病毒和宿主的博弈有些相似，机体的内部的林子大了，什么样的细胞都会有，相对机体而言有维稳的，当然就会有破坏的！而对于细胞自身而言，他们总是根据微环境的变化作出对自身最为有益的决定。

看来肝部受损依然是前提，若是这第一道防线被突破，地处咽喉之处的HSC称为下一个关键点就不足为奇了！只是如何寻找合适的药物靶点很关键，找到靶点之后如何分析，如何入手，确实值得深入研究一下。

Initiation, progression, and resolution of liverfibrosis involving hepatic stellate cells.[12]

TJ

2017年8月6日 晚

Reference

1.          Hetherington,A.M., et al., Differential LipotoxicEffects of Palmitate and Oleate in Activated Human Hepatic Stellate Cells andEpithelial Hepatoma Cells. Cell Physiol Biochem, 2016. 39(4): p. 1648-62.

2.          Yu,X.X., et al., Antisense oligonucleotidereduction of DGAT2 expression improves hepatic steatosis and hyperlipidemia inobese mice. Hepatology, 2005. 42(2):p. 362-71.

3.          Man,W.C., et al., Colocalization of SCD1 andDGAT2: implying preference for endogenous monounsaturated fatty acids intriglyceride synthesis. J Lipid Res, 2006. 47(9): p. 1928-39.

4.          Millar,J.S., et al., Short-term overexpressionof DGAT1 or DGAT2 increases hepatic triglyceride but not VLDL triglyceride orapoB production. J Lipid Res, 2006. 47(10):p. 2297-305.

5.          Rumberger,J.M., et al., Role of hexosaminebiosynthesis in glucose-mediated up-regulation of lipogenic enzyme mRNA levels:effects of glucose, glutamine, and glucosamine on glycerophosphatedehydrogenase, fatty acid synthase, and acetyl-CoA carboxylase mRNA levels.J Biol Chem, 2003. 278(31): p.28547-52.

6.          Tomimoto,D., et al., JTT-553, a novel AcylCoA:diacylglycerol acyltransferase (DGAT) 1 inhibitor, improves glucosemetabolism in diet-induced obesity and genetic T2DM mice. J Pharmacol Sci,2015. 129(1): p. 51-8.

7.          Oelkers,P., et al., Characterization of two humangenes encoding acyl coenzyme A:cholesterol acyltransferase-related enzymes.J Biol Chem, 1998. 273(41): p.26765-71.

8.          Cases,S., et al., Identification of a geneencoding an acyl CoA:diacylglycerol acyltransferase, a key enzyme intriacylglycerol synthesis. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998. 95(22): p. 13018-23.

9.          Cases,S., et al., Cloning of DGAT2, a secondmammalian diacylglycerol acyltransferase, and related family members. JBiol Chem, 2001. 276(42): p.38870-6.

10.        Lardizabal, K.D., et al., DGAT2is a new diacylglycerol acyltransferase gene family: purification, cloning, andexpression in insect cells of two polypeptides from Mortierella ramanniana withdiacylglycerol acyltransferase activity. J Biol Chem, 2001. 276(42): p. 38862-9.

11.        Meegalla, R.L., J.T. Billheimer, and D. Cheng, Concerted elevation of acyl-coenzymeA:diacylglycerol acyltransferase (DGAT) activity through independentstimulation of mRNA expression of DGAT1 and DGAT2 by carbohydrate and insulin.Biochem Biophys Res Commun, 2002. 298(3):p. 317-23.

12.        Zhang, C.Y., et al., Liverfibrosis and hepatic stellate cells: Etiology, pathological hallmarks andtherapeutic targets. World J Gastroenterol, 2016. 22(48): p. 10512-10522.