耐药细菌为何致命?

——对比来看"超级细菌"克雷伯菌的致命机制的两项研究

整理：齐云龙

导语：

本次分享香港理工大学陈声教授，中国农业大学动物医学院沈建忠院士和复旦大学附属华山医院胡付品研究员的最新研究成果！

"超级细菌"的猖獗已到了令人谈之色变的地步，其威胁也正在引起公众的关注。

当提到细菌感染的治疗时，大多数人第一反应就是使用抗生素。然而，随着抗生素的滥用，一些细菌逐渐产生了耐药性，成为了所谓的"超级细菌"。其中，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，简称CRKP）就是一种典型的"超级细菌"。

2024年7月31日，世界卫生组织（WHO）紧急发声，警告一类兼具高毒力和多药耐药特征的“超级细菌”——CR-hvKp正全球蔓延，并感叹“其感染程度被严重低估，临床致死病例或超百万”。CR-hvKp能引起动物（牛、犬猫等）和人的致命性感染，且几乎对临床上所有可选抗生素耐药，其致死率接近35%甚至更高。该菌可塑性强，面对各种环境压力能不断发生适应性演化。然而，目前缺乏关于CR-hvKp在宿主体内时间维度上的演化信息，也不清楚其体内演化是否由抗生素压力所驱动。

想象一下，如果您感染了一种细菌，医生开出的所有抗生素都失效了，这种情况会有多么可怕？这正是CRKP带来的威胁。世界卫生组织（WHO）已将CRKP列为亟需开发新型抗菌药的关键优先病原体之一。

通常情况下，我们认为细菌越耐药，其毒性就越强。但是，最新研究表明，事实可能并非如此简单。

最近香港理工大学微生物学讲座教授、化学生物学及药物研发国家重点实验室成员、食品科学及营养学系系主任陈声教授针对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌相关的高死亡率的具体机制发表了重要成果，并提示我们，开发针对 CRKP 感染的有效疗法才能显著降低该病原体引起的死亡率。

研究思路

陈声教授团队关注研究肺炎克雷伯菌致病机制多年，最新研究揭示，CRKP的高致死率并非源于其毒力的增强，而是其在抗生素治疗下的顽强存活能力。这项发表在《Microbiological Research》杂志上的研究，为我们理解"超级细菌"的致命机制提供了新的视角。

研究团队通过巧妙的实验设计，对比了CRKP与其敏感型祖先株CSKP（carbapenem-susceptible K. pneumoniae）。他们使用临床分离的CSKP菌株HKU3作为对照，通过接合转移将携带blaKPC-2基因的质粒导入HKU3中，构建了CRKP菌株HKU3-KPC。这种方法确保了两种菌株除了耐药性之外，其他遗传背景基本相同。

令人惊讶的是，研究发现两者在感染小鼠时表现出相似的毒力。它们引发的体重下降、器官细菌负荷、细胞侵入能力都没有显著差异。这意味着获得耐药性并未增强细菌的直接杀伤力。

那么，CRKP为何会导致更高的死亡率呢？研究团队通过流式细胞术、RNA测序和ELISA分析等方法，深入探讨了宿主的免疫反应。

结果显示，CRKP和CSKP都能诱导巨噬细胞向促炎的M1型极化，引发细胞因子风暴。这种过度的免疫反应可能是导致宿主死亡的主要原因。然而，当使用抗生素治疗时，情况就大不相同了。

研究人员使用美罗培南（meropenem）治疗感染的小鼠。对CSKP感染的小鼠，美罗培南治疗可以有效降低细菌负荷，抑制M1型巨噬细胞极化，减少血清细胞因子产生。但对CRKP感染则完全无效。这意味着CRKP能在抗生素治疗下存活，持续刺激免疫系统，最终导致宿主死亡。

这一发现解释了为什么临床上CRKP感染的病死率（33%-50%）显著高于CSKP感染。它也揭示了一个关键问题：在抗生素治疗失效的情况下，过度的免疫反应可能成为致命因素。

图 . CRKP 导致较高的死亡率，因为抗生素治疗后宿主的存活率更高。 

研究发现美罗培南治疗可以恢复HKU3感染小鼠的存活率，但对HKU3-KPC感染没有影响（图a ）。此外，美罗培南治疗显著改善了HKU3感染小鼠的细菌负荷和体重减轻，但没有改善HKU3-KPC感染小鼠的细菌负荷和体重减轻（图b ，c）。流式细胞术结果显示，感染HKU3后36 hpi，美罗培南治疗显著减少肺部巨噬细胞和中性粒细胞。然而，在HKU3-KPC感染后36小时，美罗培南治疗仅降低了肺和脾中中性粒细胞的频率，但没有降低肺中巨噬细胞的数量（图d ）。一致地，美罗培南治疗在HKU3感染期间显著减少CD86 +巨噬细胞，但在HKU3-KPC感染期间没有显著减少（图e ）。此外，美罗培南治疗降低了血清细胞因子水平。具体而言，在 HKU3 和 HKU3-KPC 感染期间，美罗培南将 IL-1β 和 TNF-α 的血清水平降低了近 10 倍。美罗培南治疗使HKU3感染小鼠血清IL-6水平降低10倍，是HKU3-KPC感染小鼠的10倍（图 f ）。

小结

这篇论文的主要贡献是研究了耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）与碳青霉烯类敏感肺炎克雷伯菌（CSKP）之间的毒力差异，以及这些差异如何影响临床死亡率。文章揭示：

高死亡率原因：提供的证据表明，CRKP相关的高死亡率归因于抗生素治疗期间其在宿主体内的存活率提高，导致细胞因子风暴和宿主死亡。

治疗策略启示：研究结果表明，开发针对CRKP感染的有效疗法可以显著降低该病原体引起的死亡率，并提示IL-6抑制剂可能有助于控制CRKP感染引起的细胞因子风暴。

未来研究方向：论文建议需要进一步研究不同基因组背景下肺炎克雷伯菌的获得性碳青霉烯类耐药性的作用，以及发病机制进展中的分子途径。

这项研究揭示了CRKP致命性的关键：并非毒力增强，而是其在抗生素治疗下的生存能力。这为我们应对"超级细菌"提供了新的思路。

面对耐药菌株，单纯开发新抗生素可能并非长久之计。我们需要更全面地考虑细菌与宿主免疫系统的相互作用，才能找到更有效的治疗方案。例如，研究人员提出，针对CRKP感染，可能需要同时考虑抑制过度免疫反应的治疗策略。

这项研究不仅对医学界是一个启示，也提醒我们每个人应该谨慎使用抗生素，防止更多"超级细菌"的出现。同时，它也强调了基础研究在解决临床难题中的重要性。只有深入了解病原体的致病机制，我们才能开发出更精准、更有效的治疗方法，最终战胜这些顽固的"超级细菌"。

陈声教授针对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌相关的高死亡率的具体机制的重要成果，尤其是证明了该菌致命性的关键：并非毒力增强，而是其在抗生素治疗下的生存能力，我们再来看一篇与该主题相近的沈建忠院士团队的新文章。

8月16日，美国国家科学院院刊《PNAS》杂志在线发表了中国农业大学动物医学院沈建忠院士和复旦大学附属华山医院胡付品研究员团队题为“Adaptive evolution of carbapenem-resistant hypervirulent Klebsiella pneumoniae in the urinary tract of a single patient”的研究论文。该研究报道了碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant hypervirulent Klebsiella pneumoniae, CR-hvKp）在单例宿主（患者和小鼠）尿路中以黏度表型转变为特征的适应性演化，解析了介导CR-hvKp黏度转变的分子机制，阐明了黏度转变对CR-hvKp感染与定殖的影响，这一发现为理解CR-hvKp在宿主体内的生存策略提供了新线索，同时也为未来对该类细菌的感染控制和治疗策略的开发提供了新思路。

该文章对单例阴囊脓肿合并尿路感染患者进行追踪，并分析不同病程尿液样本中CR-hvKp分离菌株的生物学特征。结果显示，经过抗生素联合治疗18天后，CR-hvKp的菌落形态出现显著性变异，其中早期菌株（Y8）呈现高黏度表型，后期菌株（Y9）呈现低黏度表型。不同形态菌株的荚膜产量、药物敏感性、生长速率和毒力等生物表型也呈现差异。全基因组对比分析发现，两株菌都属于ST11-KL64血清型，表明单个谱系内的演化而不是谱系间的替换介导了CR-hvKp的表型转换，详见图1。

图1. CR-hvKp在单例患者尿路中发生以黏度降低为特征的演化

深入分析两株菌的全基因组序列和RNAseq数据，并开展差异基因功能验证和启动子活性试验等，证实上游插入序列ISKpn26缺失引起的黏度表型调控因子rmpADC表达量下降，是介导CR-hvKp黏度转变的原因，详见图2。

图2. CR-hvKp黏度表型转变的机制

通过小鼠败血症模型、小鼠尿路感染模型、体外细菌-细胞互作和体外细菌-血清/补体互作试验等，评估了黏度转变对CR-hvKp感染与定殖的影响。结果显示黏度转变导致CR-hvKp毒力减弱：败血症模型中小鼠致死率降低了9.0倍，逃避巨噬细胞吞噬能力降低了170.0倍，在小鼠血清中的生长速率下降了11.2-40.9倍，详见图3。

图3. 黏度转变降低CR-hvKp的败血症毒力

然而，黏度转变增强了CR-hvKp的定殖能力：在小鼠尿路中的平均持留时间由6天增加到21天，对膀胱上皮细胞的黏附能力增加了216.4倍，生物膜形成能力增加了48.7%，详见图4。值得注意的是，在小鼠尿路感染模型中成功复现了CR-hvKp的黏度转变，并证明这种演变无需抗生素压力介导。荚膜合成及调控基因wcaJ和rmpA是介导CR-hvKp体内演化的突变热点，而ISKpn26在此过程中发挥关键作用。

图4. 黏度转变增强CR-hvKp的尿路定殖能力

总之，该研究发现以黏度转变为特征的适应性演化降低了CR-hvKp毒力，但赋予了其尿道生存优势，这种演化不依赖于抗生素压力驱动，是CR-hvKp权衡其感染与定殖能力的结果。

中国农业大学博士毕业生宋士凯（现就职于山东省农业科学院家禽研究所）、硕士毕业生杨诗鑫和在校博士生郑瑞程为论文第一作者，兽医公共卫生安全全国重点实验室沈建忠院士、吴聪明教授、汪洋教授和复旦大学附属华山医院抗生素研究所胡付品研究员为论文共同通讯作者。该研究受国家自然科学基金专项项目“重要耐药菌/耐药基因在“动物-环境-人群”链条中的传播机制和风险研究”（32141002）等资助。

关于治疗

2020年9月，第四届中国动物健康与食品安全大会上，沈建忠院士曾指出，延长现有抗菌药物的使用寿命可谓迫在眉睫，这需要加强精准诊断、合理用药，降低“选择性压力”；发展宿主导向的抗菌疗法；以及开发新型抗菌增效剂，实现联合用药。

在抗生素替代品的研发上，沈建忠院士认为植物提取物“很有前途”，其它如益生菌、噬菌体、中药等亦发展迅速，逐渐成为保障“减抗替抗”政策实施的主力产品。

2021年7月，在第五届中国动物健康与食品安全大会上，沈建忠院士特别强调：在替抗产品中，除植物提取物外，只有噬菌体及其裂解酶是有明确抗菌作用的。

具体就多重耐药性肺炎克雷伯菌而言，此前已经有多项研究证明噬菌体疗法具有显著效果，可以减少细菌数量和生物膜的形成，进而对其进行清除。

例如，有学者对雾化吸入噬菌体治疗泛耐药肺炎克雷伯菌肺部感染的效果进行了评估，表明噬菌体能够有效地针对目标细菌进行杀灭并改善患者的临床症状，泛耐药肺炎克雷伯菌肺部感染患者经过2次雾化吸入治疗即可达到噬菌体使用的最佳效果。

引用文献：

1. Yang C, Xu Q, Xie M, et al. Enhancing resistance, but not virulence attributed to the high mortality caused by carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae[J]. Microbiological Research, 2024, 285: 127769.

2. Song S, Yang S, Zheng R, et al. Adaptive evolution of carbapenem-resistant hypervirulent Klebsiella pneumoniae in the urinary tract of a single patient[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2024, 121(35): e2400446121.